大叶落地生根KdSOC1基因的克隆与功能的初步鉴定

发布时间：2017-04-26 07:18

  本文关键词：大叶落地生根KdSOC1基因的克隆与功能的初步鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：大叶落地生根(Kalanchoe daigremontiana),为景天科伽蓝菜属多年生草本植物,叶缘所形成的胎生苗是无性繁殖的方式,是典型的植物体细胞全能性的体现,即叶缘体细胞直接通过分化形成新个体。然而针对这种极为特殊的无性繁殖方式,迄今没有研究阐明胎生苗形成过程所涉及的分子调控网络。在实验室前人构建的落地生根cDNA文库中,发现一个与拟南芥SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1(SOC1)基因同源的EST序列(contig1019)。本研究通过RACE和Genome Walking技术克隆了KdSOC1基因cDNA全长和启动子,进行了相关生物信息学分析,探究了该基因的表达模式并构建了大叶落地生根遗传转化体系及愈伤组织诱导体系,为后期深入研究KdSOC1基因功能奠定了基础。主要结论如下：1通过RACE技术获得KdSOC1基因cDNA全长为1410bp,BLAST比对发现与山核桃SOC1基因同源性相似度达70%,故而命名为KdSOC1基因。其ORF全长为684bp,编码227个氨基酸,CDS具有保守区域MADS-MEF2-like和K-bcx,属于植物MADS Ⅱ型基因。2通过Genome Walking技术获得KdSOC1启动子序列为1401bp,进行顺式作用元件预测发现该基因具有ABRE (ABA作用元件)、CGTCA-motif (MeJA作用元件)、GARE-motif(GA作用元件)、TCA-element (SA作用元件)、rbcS-CMA7a(光响应作用元件)、TATA-box (核心转录起始单元)、CAA-box(转录起始单元)。说明该基因受到多种激素信号的调节,同时参与多个代谢反应。3在启动子顺式作用元件预测基础上,结合实时荧光定量PCR和半定量RT-PCR技术分析了该基因在激素(ABA、SA、GA、MeJA)诱导下及不同环境(自然干旱和长短日照)下的表达模式。激素诱导结果表明,KdSOC1基因对ABA、GA、MeJA和SA激素均有响应,而对SA和GA响应显著且持久。不同光周期诱导结果显示,LD诱导下,植物叶片中KdSOC1基因的表达水平高于SD诱导下的表达量；LD诱导下,KdSOC1基因的表达量急速增加,培养37天时该基因的表达量相对于28天时增加了约10倍,同时伴随胎生苗的快速产生。自然干旱结果显示,随着干旱程度的加深,KdSOC1基因的表达量逐渐增多,轻度干旱时基因的表达水平高于CK1,而中度、重度干旱时基因的表达水平低于CK2-3,此现象与植株产生胎生苗的情况一致。因此,KdSOC1基因能感知和传递环境刺激信号并参与胎生苗的形成。4本研究构建了过表达载体pBIN438-ORF KdSOCI、RNA干扰载体pZH01-AS ORF KdSOC1-GUS-S ORFKdSOC1及启动子载体pBI121-PromoterKedSOC1-GUS载体,并以pBI438载体(NPTⅡ作为筛选标记基因)初步成功构建了落地生根转化体系,为深入研究该基因的功能及其对胎生苗形成的调控机制奠定基础。5为创建胎生苗“体细胞”体外快速研究体系,本研究初步建立高效、高质量落地生根愈伤组织诱导体系,以MS为基本培养基,添加不同浓度6-BA与2,4-D对主茎段、幼嫩及成熟叶片三种外植体进行愈伤组织诱导。研究结果表明,主茎段最佳愈伤诱导激素浓度比例为0.5mg/L 6-BA:0.5mg/L 2,4-D,胚性愈伤发生率为55.56%；幼嫩叶片最佳愈伤诱导激素浓度比例为lmg/L 6-BA:1.5mg/L 2,4-D,胚性愈伤发生率为29.92%；成熟叶片最佳愈伤诱导激素浓度比例为2.5mg/L6-BA:0.5mg/L 2,4-D,胚性愈伤发生率为43.07%。因此主茎段与成熟叶片均为诱导大叶落地生根愈伤组织形成的理想材料。
【关键词】：大叶落地生根 胎生苗的形成 KdSOC1 表达分析 遗传转化
【学位授予单位】：北京林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-7
• 缩略词7-13
• 1 引言13-21
• 1.1 大叶落地生根胎生苗形成研究概况13-16
• 1.1.1 胎生苗的形成发育过程13-14
• 1.1.2 胎生苗的形成发育过程中相关基因与功能研究14-15
• 1.1.3 无性繁殖演变15-16
• 1.2 大叶落地生根遗传转化的研究进展16
• 1.3 SOC1基因的研究进展16-19
• 1.3.1 SOC1基因的发现与结构特征17
• 1.3.2 SOC1基因的表达调控17-18
• 1.3.3 SOC1基因的功能18-19
• 1.4 本研究目的内容及技术路线19-21
• 1.4.1 研究背景19
• 1.4.2 研究目的19
• 1.4.3 研究内容19-20
• 1.4.4 技术路线20-21
• 2 大叶落地生根KdSOC1基因cDNA的获得及生物信息分析21-33
• 2.1 实验材料21
• 2.1.1 植物材料21
• 2.1.2 主要酶与试剂21
• 2.1.3 主要仪器设备21
• 2.1.4 常用培养基21
• 2.2 实验方法21-27
• 2.2.1 大叶落地生根叶片总RNA的提取21
• 2.2.2 大叶落地生根cDNA的合成21-22
• 2.2.3 KdSOC1基因全长的获得22-26
• 2.2.4 KdSOC1基因序列的生物学分析26-27
• 2.2.5 多重序列比对与系统进化分析27
• 2.3 结果与分析27-32
• 2.3.1 KdSOC1基因的克隆与序列分析27-28
• 2.3.2 KdSOC1蛋白序列分析及三级结构预测28-30
• 2.3.3 同源性比较及系统进化分析30-32
• 2.4 讨论32-33
• 3 大叶落地生根KdSOC1基因启动子的克隆与分析33-40
• 3.1 实验材料33
• 3.1.1 植物材料33
• 3.1.2 主要酶与试剂33
• 3.1.3 主要仪器设备33
• 3.1.4 常用培养基33
• 3.2 实验方法33-36
• 3.2.1 大叶落地生根DNA的提取33
• 3.2.2 KdSOC1基因启动子的克隆33-36
• 3.2.3 生物信息学分析36
• 3.3 结果与分析36-39
• 3.3.1 大叶落地生根KdSOC1基因启动子的克隆37
• 3.3.2 大叶落地生根KdSOC1基因启动子序列分析37-39
• 3.4 讨论39-40
• 4 大叶落地生根KdSOC1基因的表达分析40-48
• 4.1 实验材料与处理40-41
• 4.1.1 实验材料40
• 4.1.2 材料处理40-41
• 4.2 实验方法41-42
• 4.2.1 不同处理下落地生根总RNA的提取及cDNA的合成41
• 4.2.2 实时荧光定量PCR41-42
• 4.2.3 半定量RT-PCR42
• 4.3 结果与分析42-45
• 4.3.1 KdSOC1基因在不同激素诱导下的表达分析42-43
• 4.3.2 KdSOC1基因在不同光周期下的表达分析43-44
• 4.3.3 干旱胁迫下KdSOC1基因的表达分析44-45
• 4.4 讨论45-48
• 4.4.1 不同激素诱导下KdSOC1基因的表达分析45-46
• 4.4.2 不同光周期下KdSOC1基因的表达分析46
• 4.4.3 自然干旱处理下KdSOC1基因的表达分析46-48
• 5 大叶落地生根遗传转化体系的构建48-61
• 5.1 实验材料48
• 5.1.1 植物材料48
• 5.1.2 载体与菌株48
• 5.1.3 主要酶与试剂48
• 5.1.4 主要仪器设备48
• 5.1.5 主要培养基48
• 5.2 实验方法48-53
• 5.2.1 RNA的提取及cDNA的合成48-49
• 5.2.2 引物设计49
• 5.2.3 过表达载体pBIN438-ORF_(KdSOC1)的构建49-51
• 5.2.4 干扰载体pZH01-AS ORF_(KdSOC1)-GUS-S ORF _(KdSOC1)的构建51-52
• 5.2.5 启动子载体pBI121-Promoter_(KdSOC1)-GUS的构建52
• 5.2.6 农杆菌感受态细胞的转化及鉴定52
• 5.2.7 植物表达载体转化大叶落地生根52-53
• 5.2.8 主要仪器设备53
• 5.2.9 主要培养基53
• 5.3 结果与分析53-59
• 5.3.1 过表达载体的构建53-54
• 5.3.2 干扰载体的构建54
• 5.3.3 启动子载体的构建54-55
• 5.3.4 落地生根不同外植体的瞬时转化效率55-56
• 5.3.5 参考Truesdale MR等建立的落地生根转化体系56-57
• 5.3.6 类似于拟南芥花粉转化法57
• 5.3.7 参考Garces等人建立的落地生根转化体系57-59
• 5.4 讨论59-61
• 5.4.1 落地生根转化效率59
• 5.4.2 落地生根遗传转化体系59-61
• 6 大叶落地生根愈伤组织诱导体系的优化61-73
• 6.1 实验材料61
• 6.1.1 植物材料61
• 6.1.2 菌株与质粒61
• 6.1.3 主要试剂61
• 6.1.4 主要仪器设备61
• 6.2 方法61-62
• 6.2.1 外植体处理61
• 6.2.2 培养基及培养条件61-62
• 6.2.3 愈伤组织诱导62
• 6.2.4 数据统计分析62
• 6.2.5 落地生根愈伤组织的瞬时转化62
• 6.3 结果与分析62-71
• 6.3.1 不同外植体愈伤诱导效率62-64
• 6.3.2 植物激素配比对不同外植体愈伤组织诱导的影响64-69
• 6.3.3 不同外植体最佳愈伤诱导激素比例69-70
• 6.3.4 侵染时间对落地生根愈伤组织瞬时转化的影响70-71
• 6.4 讨论71-73
• 6.4.1 大叶落地生根愈伤组织诱导71
• 6.4.2 大叶落地生根愈伤组织瞬时转化71-73
• 7 总结与展望73-75
• 7.1 总结73
• 7.2 展望73-75
• 参考文献75-81
• 个人简介81-82
• 导师简介82-83
• 致谢83

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 刘建华;大叶落地生根是营养繁殖的好材料[J];生物学通报;2002年10期

2 游义霞;黄先忠;郑银英;崔百明;;大叶落地生根STM基因植物表达载体构建及烟草转化[J];石河子大学学报(自然科学版);2012年03期

3 ;[J];;年期

中国重要会议论文全文数据库 前1条

1 王一U，

本文编号：328005