花绒寄甲热休克蛋白基因表达研究

发布时间：2017-04-26 08:19

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【摘要】：花绒寄甲(Dastarcus helophoroides Sharp)是天牛类林木蛀干害虫的有效天敌昆虫,在自然界中其生命活动无时无刻要承受很多不利于生长生存的影响因子的威胁,如极端的高低温、氧化、饥饿等环境胁迫。花绒寄甲经长期的自然适应中,具备很强的环境适应能力。热休克蛋白(Heat Shock Protein)作为生物体内的应激蛋白,在调节和适应环境中的不良刺激以维持机体正常的生长发育的过程中具有重要作用。为阐明热休克蛋白HSP70(Heat Shock Protein 70)与sHSP(small Heat Shock Protein)在花绒寄甲发育历期及雌雄成虫抵抗环境胁迫中的作用,利用实时荧光定量PCR技术分析其在发育阶段和不同环境胁迫时表达情况。本研究的主要结果如下:从花绒寄甲成虫转录组数据库得到3条HSP70基因和3条小分子热休克蛋白,即D.hHSP69.09、D.hHSP70.11、D.hHSP71.88及D.hsHSP11.06、D.hsHSP11.10和D.hsHSP20.99,其ORF大小分别为1980、1967、1910bp、444、574和789bp;编码氨基酸个数为626、636、655、102、102和185;理论等电点为5.57、6.01、5.93、9.52、8.01和6.31;分子量大小为69.09kDa、70.11kDa、71.88kDa、11.06kDa、11.10kDa和20.99kDa。在花绒寄甲不同发育阶段,最高表达量为:D.hHSP69.09在1龄幼虫期,D.hHSP70.11和D.hHS71.88在雄虫;D.hsHSP11.06和D.hsHSP11.10的最高的表达水平出现在2龄幼虫阶段,D.hsHSP20.09在5龄幼虫阶段。不同组织中的最高表达量为:D.hHSP69.09和D.hHSP70.11在卵巢,D.hHSP71.88和D.hsHSP11.06在脂肪体,D.hsHSP11.10和D.hsHSP20.99基因在精巢中表达量最高。D.hHSP69.09在雌虫中表达量显著高于雄虫;D.hHSP70.11和D.hHSP71.88在雄虫中表达量显著高于雌虫。HSP基因表达量最高时对应的温度为35℃或38℃。HSP基因在41℃高温刺激下,均出现时间效应。氧化剂处理后D.hHSP69.09、D.hsHSP11.10和D.hs HSP20.99在雌虫中的表达量显著高于雄虫,D.hHSP70.11和D.hHSP71.88为雄虫显著高于雌虫,且HSP基因表达量最高时所对应的浓度在20m M和30mM之间。花绒寄甲雌虫耐饥饿能力高于雄虫。随饥饿时间延长,雄虫中HSP70基因表达量降低。雌成虫中D.hHSP69.09在饥饿第2天时表达量略微上升;D.hHSP70.11在饥饿处理前4天表达量降低,后略微上升,第8天时表达量达到最高。D.hHSP71.88基因的表达量饥饿处理后上升,第8天表达量骤升。雄虫中D.hsHSP11.06最大表达水平在第2天,雌虫在第6~12天;D.hsHsp11.10雄虫最大表达水平在第6~10天,雌虫在第4天;D.hsHsp 20.99雄虫最大表达水平在第6天,雌虫在第4天。综上所述,花容寄甲HSP70和sHSP基因均能响应各种环境胁迫,在其生长发育、繁殖与耐高温、抗氧化、耐饥饿等过程中发挥重要作用。
【关键词】：花绒寄甲 HSP70 sHSP 环境胁迫 RT-qPCR
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S763.306.4
【目录】：

• 摘要6-8
• abstract8-12
• 第一章 文献综述12-19
• 1.1 花绒寄甲研究进展12-14
• 1.1.1 花绒寄甲的生物学研究12-13
• 1.1.2 花绒寄甲的人工繁育方面研究13
• 1.1.3 花绒寄甲生物防治作用方面研究13
• 1.1.4 花绒寄甲的抗性研究13-14
• 1.2 热休克蛋白的研究进展14-17
• 1.2.1 热休克蛋白的发现与分类14-15
• 1.2.2 热休克蛋白的结构特征15
• 1.2.3 热休克蛋白的生物学功能15-17
• 1.3 本试验的目的意义以及创新点17-18
• 1.3.1 本试验的目的意义17-18
• 1.3.2 本试验的创新点18
• 1.4 研究内容及技术路线18-19
• 1.4.1 研究内容18
• 1.4.2 技术路线18-19
• 第二章 材料与方法19-23
• 2.1 实验材料19-20
• 2.1.1 试虫19
• 2.1.2 实验仪器19
• 2.1.3 实验药品19-20
• 2.2 花绒寄甲HSP基因的序列检索20
• 2.3 HSP基因序列分析及进化树构建20
• 2.4 花绒寄甲总RNA的提取、纯化和鉴定20-21
• 2.4.1 利用TRIZOL Kit提取总RNA20
• 2.4.2 花绒寄甲总RNA的检测20-21
• 2.4.3 cDNA第一链的合成和纯化21
• 2.5 实时荧光定量PCR分析基因的表达21-23
• 2.5.1 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)内参引物、反应体系及反应条件的确定21-22
• 2.5.2 实时荧光定量PCR分析22
• 2.5.3 数据处理22-23
• 第三章 结果与分析23-41
• 3.1 花绒寄甲HSP70基因的分子特性与表达分析23-32
• 3.1.1 花绒寄甲HSP70基因cDNA的检索及序列分析23-25
• 3.1.2 定量PCR25-32
• 3.2 花绒寄甲sHSP基因的分子特性与表达分析32-41
• 3.2.1 花绒寄甲sHSP基因cDNA的检索及序列分析32-34
• 3.2.2 定量PCR34-41
• 第四章 讨论41-44
• 4.1 花绒寄甲HSP基因的结构41
• 4.1.1 花绒寄甲HSP70基因的结构41
• 4.1.2 花绒寄甲sHSP基因的结构41
• 4.2 花绒寄甲HSP基因的时间和空间特异性41-42
• 4.2.1 花绒寄甲HSP70基因的时间和空间特异性41-42
• 4.2.2 花绒寄甲sHSP基因的时间和空间特异性42
• 4.3 花绒寄甲HSP基因在不同非生物应激中的表达特性42-44
• 4.3.1 花绒寄甲HSP70基因在不同非生物应激中的表达特性42-43
• 4.3.2 花绒寄甲sHSP基因在不同非生物应激中的表达特性43-44
• 第五章 结论、创新点和研究展望44-46
• 5.1 主要结论44
• 5.1.1 获得3条HSP70和3条sHSP cDNA序列44
• 5.1.2 明确3条HSP70和3条sHSP基因的时间和空间分布特性44
• 5.1.3 明确3条HSP70和3条sHSP基因在不同非生物应激中的表达特性44
• 5.2 创新点44
• 5.3 研究展望44-46
• 参考文献46-51
• 致谢51-52
• 作者简介52

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本文编号：328091