过表达psd基因与添加表面活性剂对胞苷发酵的影响研究

发布时间：2021-07-14 02:10

　　胞苷是核苷酸类保健食品和功能性食品的原料之一,也是合成多种抗病毒、抗肿瘤药物的中间体,主要通过微生物直接发酵法获得。菌体细胞膜对发酵过程中胞苷的分泌有重要影响。本文以解淀粉芽孢杆菌BG-09和大肠杆菌BG-12为研究对象,对细胞膜渗透性相关的基因psd和不同的表面活性剂进行研究,分别分析了同源和异源过量表达psd基因对胞苷发酵的影响,探讨了ps 基因在胞苷分泌过程中的作用;在大肠杆菌BG-12发酵过程中添加4种不同表面活性剂,研究其对胞苷发酵和细胞膜渗透性的影响。主要研究内容的结果如下:1.psd基因过量表达载体的构建。通过途径分析,发现解淀粉芽孢杆菌中磷脂酰丝氨酸脱竣酶（EC:4.1.1.65,由psd基因编码）与菌体细胞膜磷脂合成密切相关。以解淀粉芽孢杆菌BG-09基因组DNA为模板,扩增psd基因,连接到质粒pHT43中,经酶切验证与电泳分析可知,构建成功,获得重组表达载体pHT43-ppsd。2.过表达psd基因对解淀粉芽孢杆菌BG-09胞苷发酵的影响。将构建的重组表达载体pHT43-psd电转化至Bacillus amyloliquefaciens BG-09 中,获得重组菌... 

【文章来源】：宁夏大学宁夏回族自治区 211工程院校

【文章页数】：75 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图１－２甘油磷脂代谢途径［４７］??Ｆｉｇ．?１－２?Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ?ｍｅｔａｂｏｌｉｃ?ｐａｔｈｗａｙ??细?

图１－３过量表达技术路线图??Ｆｉｇ．?１－３?Ｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ?Ｒｏａｄｍａｐ??表面活性剂对胞苷发酵的影响的技术路线图如图１－４所示。??ｒ?Ｘ?／＊????＇??Ｓ??大肠杆菌ＢＧ－１２??？表面活性剂??Ｖ?－????Ｖ?－Ｊ??／?Ｎ????＼??测定菌体生长、耗糖速率及胞苷浓度?Ｔｗｅｅｎ－８０．?ＨｉｔｏｎＸ－ｌＯＯ．?Ｃ＇ＴＡＢ．?ＥＭＢ??Ｊ????１?，??分析添加不同表面活性剂对大肠杆菌ＢＧ－１２??胞苷发酵及细胞膜渗透性的影响??Ｖ－??．．．．?＾??图１－４表面活性剂对胞苷发酵影响的技术路线图??Ｆｉｇ．?１－４?Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ?Ｒｏａｄｍａｐ?ｏｆ?ｔｈｅ?Ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ?ｏｎ?Ｃ＞ｔｉｄｉｎｅ?Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ??－８－??

注：Ｍ．ＤＬｌＯＯＯＯＤＮＡＭａｒｋｅｒ；?１、２：ＰＣＲ?扩增产物?注：Ｍ．ＤＬ１００００?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ；?１、２：ＰＣＲ?扩增产物回收??图２－１目的片段的ＰＣＲ扩增结果?图２－２目的片段ＰＣＲ纯化回收??Ｆｉｇ．?２－１?Ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｔａｒｇｅｔ?ｆｒａｇｍｅｎｔ?Ｆｉｇ．?２－２?Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ａｎｄ?Ｒｅｃｏｖｅｒｙ?ｏｆ?Ｔａｒｇｅｔ?ｂｙ?ＰＣＲ??（２）?ＴＡ克隆载体鉴定??将ＰＣＲ扩增目的片段纯化回收，取回收产物克隆在ｐＭＤ１９－Ｔ?Ｖｅｃｔｏｒ上并转化至五．ｃｏｈ??ＤＨ５ａ感受态细胞中，涂布于含有Ｘ－Ｇａｌ、ＩＰＴＧ和Ａｍｐ的ＬＢ固体培养基中，ＴＡ克隆菌落如图??２－３所示，图中出现较多白斑，说明有假阳性出现，挑取克隆菌落分别逐一进行菌落ＰＣＲ鉴??定，结果如图２－４表明，扩增产物大小在８８４ｂｐ左右的即与目标条带大小一致，可初步鉴定为阳??性克隆菌株。??图２－３?ＴＡ克隆菌落形态??Ｆｉｇ．?２－３?Ｃｏｌｏｎｙ?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｏｆ?ＴＡ?ｃｌｏｎｅ??ｉｊ＾Ｈ??注：Ｍ．ＤＬ１００００?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ；?１？２４：阳性菌落扩增产物，其中１９条带不正确??图２－４重组质粒ＴＡ－＿ｐｓｄ菌落ＰＣＲ鉴定结果??Ｆｉｇ．?２－４?Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?Ｐｌ


本文编号：3283191