SlMAPK4基因敲除对番茄果实抗冷性的影响
发布时间：2021-07-16 20:41
番茄是一种冷敏型植物,无论植株生长发育还是采后番茄果实运输或贮藏,都极易受到低温的伤害。MAPK家族基因是植物抗冷信号转导途径中的关键基因,MAPK级联途径是植物抗冷调控过程中的重要环节。本文以“丽春”番茄为实验材料,结合现代分子生物学和转基因理论,采用CRISPR/Cas9基因编辑技术,尝试培育SlMAPK4基因突变番茄植株,并探究SlMAPK4基因敲除对番茄果实抗冷性的影响。本文主要实验结果如下:（1）在5’端ORF区以及基因外显子功能结构域分别构建了1个靶点位。后对靶点序列在SlMAPK4基因座中的位置进行分析,验证了两靶点均处于外显子序列中。（2）根据靶接头设计原则,设计出了第一轮Overlapping PCR所需引物,后经二轮PCR,完成了sgRNA表达盒BsaⅠ酶切位点的添加。经pYLCRISPR/Cas9-SlMAPK4载体测序及农杆菌菌落PCR验证,证实pYLCRISPR/Cas9-SlMAPK4载体成功导入农杆菌基因组中。（3）经过PHT（潮霉素）基因的PCR检测,共获得阳性植株40棵,经测序T0代的打靶率在70%左右。据T1
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：92 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
MAPK级联介导不同的信号传导途径（Ichimuraetal.,1998）
vtunetal.,2000）。拟南芥ROS清除酶系统非常复杂，由15个基因家族共148个基因进行编码（Mittleretal.,2004），9个基因家族23个基因表达在mekk1、mapkk1/2和mapk4突变缺失型株中受到抑制作用（Pitzschkeetal.,2009）。拟南芥mekk1、mapkk1/2和mapk4突变体植株，负责类囊体过氧化物酶（thylakoidalperoxidase,tAPX）和过氧化氢酶（catalase,CAT）的编码基因表达会受到抑制（Yoshiokaetal.,2003）。同时研究发现，拟南芥H2O2发生积累时，MAPK生物活性被激活，同时可正调控抗性基因GST6和HSP18.2的表达（Kovtunetal.,2000）。图1-2MAPK级联响应非生物胁迫下ROS信号（Kovtunetal.,2000）Fig1-2MAPKcascadesrespondtotheresultingoxidativeburstandmayregulateROSaccumulation
SlMAPK4基因敲除对番茄果实抗冷性的影响10于野生型植株（Jaglo-Ottosenetal.,1998）。CBF基因的抗冷能力较大程度取决与其对下游抗冻蛋白基因表达的调控。CBF蛋白含有AP2/DNA结合域，可与下游基因启动子CRT/DRE元件结合，并对其表达产生调控（Medinaetal.,1999）。目前所发现启动子中含有CRT/DRE元件的基因有：COR15a、COR47/RD17、COR78/RD29A、COR6.6/KIN2、KIN1，其中对COR15a研究最为深入。COR15a的功能定位在叶绿体机制上，其肽链存在α-螺旋，具有亲水性，可改变叶绿体被膜折叠以推迟六边形堆积结构体的形成，具有保护叶绿体和原生质体，提高抗冷胁迫能力的作用。（Jaglo-Ottosenetal.,1998；Zhangetal.,2004）。Zhao等构建了拟南芥AtCBF1、AtCBF2、AtCBF3三个基因突变体植株，在低温胁迫条件下，RD29A、COR15a、KIN1、及COR47的基因表达量明显下降（Zhaoetal.,2016）。Zhang等研究表明番茄中具有完整的CBF冷应答途径，但番茄中CBF下游基因家族较拟南芥明显减少。拟南芥中研究较为透彻的COR基因家族在番茄中无法找到。通过构建番茄SlCBF1及SlCBF3超表达植株，研究发现SlCBF3超表达植株其下游cLER1P6、cLER17C11、cLET13N19和cSlR1E13基因表达量高于对照的2.5倍（Zhangetal.,2004）。赵（2009）也进一步验证在番茄中，cSlR1P6及cSlR17C11受低温胁迫伴随SlCBF1的表达而表达，推测cLER1P6和cLER17C11为番茄SlCBF1下游基因，与拟南芥中COR基因家族的功能相似。图1-3CBF抗冷信号途径的组成模式（Chinnusamyetal.,2003）Fig.1-3CBFcoldsignaltransductionpathway
【参考文献】：
期刊论文
[1]系统Ⅱ乙烯对采后番茄果实抗冷过程中抗氧化酶的影响[J]. 吕胜男,赵瑞瑞,申琳,赵丹莹,生吉萍. 食品科学. 2012(08)
[2]脯氨酸与植物抗寒性的研究进展[J]. 王小华,庄南生. 中国农学通报. 2008(11)
[3]H2O2参与冷激处理对番茄果实抗冷性及抗氧化酶活性的影响[J]. 欧阳丽喆,申琳,陈海荣,范蓓,郑杨,孙建军,生吉萍. 食品科学. 2007(07)
[4]10℃低温对绿豆和豌豆下胚轴细胞一些抗氧化酶活性和超微结构的影响[J]. 陈旭微,杨玲,章艺,巩菊芳. 植物生理与分子生物学学报. 2005(05)
[5]几种外源物质提高植物抗冷力的生理机制[J]. 康国章,王正询,孙谷畴. 植物生理学通讯. 2002(02)
[6]水分胁迫对芒果（Mangifera indica L.）幼叶细胞活性氧伤害的影响[J]. 陈由强,朱锦懋,叶冰莹. 生命科学研究. 2000(01)
[7]氮蓝四唑光化还原法测定超氧化物歧化酶活性的适宜条件[J]. 沈文飚,徐朗莱,叶茂炳,张荣铣. 南京农业大学学报. 1996(02)
本文编号：3287725
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：92 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
MAPK级联介导不同的信号传导途径（Ichimuraetal.,1998）
vtunetal.,2000）。拟南芥ROS清除酶系统非常复杂，由15个基因家族共148个基因进行编码（Mittleretal.,2004），9个基因家族23个基因表达在mekk1、mapkk1/2和mapk4突变缺失型株中受到抑制作用（Pitzschkeetal.,2009）。拟南芥mekk1、mapkk1/2和mapk4突变体植株，负责类囊体过氧化物酶（thylakoidalperoxidase,tAPX）和过氧化氢酶（catalase,CAT）的编码基因表达会受到抑制（Yoshiokaetal.,2003）。同时研究发现，拟南芥H2O2发生积累时，MAPK生物活性被激活，同时可正调控抗性基因GST6和HSP18.2的表达（Kovtunetal.,2000）。图1-2MAPK级联响应非生物胁迫下ROS信号（Kovtunetal.,2000）Fig1-2MAPKcascadesrespondtotheresultingoxidativeburstandmayregulateROSaccumulation
SlMAPK4基因敲除对番茄果实抗冷性的影响10于野生型植株（Jaglo-Ottosenetal.,1998）。CBF基因的抗冷能力较大程度取决与其对下游抗冻蛋白基因表达的调控。CBF蛋白含有AP2/DNA结合域，可与下游基因启动子CRT/DRE元件结合，并对其表达产生调控（Medinaetal.,1999）。目前所发现启动子中含有CRT/DRE元件的基因有：COR15a、COR47/RD17、COR78/RD29A、COR6.6/KIN2、KIN1，其中对COR15a研究最为深入。COR15a的功能定位在叶绿体机制上，其肽链存在α-螺旋，具有亲水性，可改变叶绿体被膜折叠以推迟六边形堆积结构体的形成，具有保护叶绿体和原生质体，提高抗冷胁迫能力的作用。（Jaglo-Ottosenetal.,1998；Zhangetal.,2004）。Zhao等构建了拟南芥AtCBF1、AtCBF2、AtCBF3三个基因突变体植株，在低温胁迫条件下，RD29A、COR15a、KIN1、及COR47的基因表达量明显下降（Zhaoetal.,2016）。Zhang等研究表明番茄中具有完整的CBF冷应答途径，但番茄中CBF下游基因家族较拟南芥明显减少。拟南芥中研究较为透彻的COR基因家族在番茄中无法找到。通过构建番茄SlCBF1及SlCBF3超表达植株，研究发现SlCBF3超表达植株其下游cLER1P6、cLER17C11、cLET13N19和cSlR1E13基因表达量高于对照的2.5倍（Zhangetal.,2004）。赵（2009）也进一步验证在番茄中，cSlR1P6及cSlR17C11受低温胁迫伴随SlCBF1的表达而表达，推测cLER1P6和cLER17C11为番茄SlCBF1下游基因，与拟南芥中COR基因家族的功能相似。图1-3CBF抗冷信号途径的组成模式（Chinnusamyetal.,2003）Fig.1-3CBFcoldsignaltransductionpathway
【参考文献】：
期刊论文
[1]系统Ⅱ乙烯对采后番茄果实抗冷过程中抗氧化酶的影响[J]. 吕胜男,赵瑞瑞,申琳,赵丹莹,生吉萍. 食品科学. 2012(08)
[2]脯氨酸与植物抗寒性的研究进展[J]. 王小华,庄南生. 中国农学通报. 2008(11)
[3]H2O2参与冷激处理对番茄果实抗冷性及抗氧化酶活性的影响[J]. 欧阳丽喆,申琳,陈海荣,范蓓,郑杨,孙建军,生吉萍. 食品科学. 2007(07)
[4]10℃低温对绿豆和豌豆下胚轴细胞一些抗氧化酶活性和超微结构的影响[J]. 陈旭微,杨玲,章艺,巩菊芳. 植物生理与分子生物学学报. 2005(05)
[5]几种外源物质提高植物抗冷力的生理机制[J]. 康国章,王正询,孙谷畴. 植物生理学通讯. 2002(02)
[6]水分胁迫对芒果（Mangifera indica L.）幼叶细胞活性氧伤害的影响[J]. 陈由强,朱锦懋,叶冰莹. 生命科学研究. 2000(01)
[7]氮蓝四唑光化还原法测定超氧化物歧化酶活性的适宜条件[J]. 沈文飚,徐朗莱,叶茂炳,张荣铣. 南京农业大学学报. 1996(02)
本文编号：3287725
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