张应力对小鼠成骨细胞增殖分化的影响及基因谱差异分析

发布时间：2017-04-27 04:09

  本文关键词：张应力对小鼠成骨细胞增殖分化的影响及基因谱差异分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:正畸治疗和牵张成骨的生物学基础是颅颌面部骨组织对应力刺激的适应性改建作用,在骨改建的过程中,成骨细胞起着重要的作用,成骨细胞是骨组织中的主要细胞,也是体内的应力敏感型细胞,在骨代谢过程中具有中心调控作用。适宜强度和作用时间的应力刺激可有效促进成骨细胞的增殖活性,诱导新骨形成,但细胞是如何感知外界力学刺激信号并将其转变为胞内生物学信号的转导机制尚不明确。以往学者们只对一个或几个相关基因进行研究,很难全面的了解成骨细胞对力学信号应答的分子机制。故本实验使用Flexcell 5000细胞拉伸加载装置对体外培养的小鼠成骨细胞MC3T3-E1加载周期性牵张应力,用MTT法检测张应力对成骨细胞增殖分化的影响,并筛选出促进成骨细胞增殖的最适力值,采用Affymetrix基因表达谱芯片技术,检测最适应力刺激成骨细胞后全基因组差异基因的表达情况,通过基因差异分析,从分子水平探讨成骨细胞对力学信号的应答机制,为临床上正畸治疗和牵张成骨提供分子理论基础。方法:1成骨细胞的复苏和传代培养将冻存的原代小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1进行细胞复苏,镜下观察细胞生长情况,待细胞长满瓶底80%,且生长状况良好时进行细胞传代。2成骨细胞的接种取生长状态良好的第5代成骨细胞,制备成单细胞悬液,以2×105/孔的细胞浓度接种于5个Bioflex弹性基底膜六孔培养板中,培养24 h后将培养液更换为低浓度血清培养液,使之同步化生长24 h后待用。3建立成骨细胞体外加力模型将5个6孔培养板随机分为A、B、C、D、E五组,每组6孔,每孔换成2 ml 10%血清培养液,使用Flexercell 5000应力加载仪进行加力,每组分别施加0%、6%、12%、18%、22%的拉伸力,频率0.1 Hz,即6周/min(5 S牵拉,5 S松弛),波形为1/2正弦,加力时间为24 h。4成骨细胞增殖活性的检测加力结束后,使用mtt法检测各组细胞的增殖情况,用酶联免疫检测仪检测各组细胞在490nm处的吸光度值(opticaldensity,od),记录数据,并使用spss19.0统计软件进行统计分析。5细胞总rna的提取收集最适应力组和对照组的细胞,使用trizol法提取细胞的总rna,并测定rna的纯度和完整性。6基因芯片检测应用affymetrix全基因组表达谱芯片检测最适应力组和对照组的基因表达水平并扫描分析。采用transcriptomeanalysisconsole3.0分析软件对扫描结果进行分析,筛选差异基因。结果:1mtt结果:成骨细胞加载周期性张应力24h后各组吸光度值的比较:(1)0%对照组(a组):0.3931±0.0538(2)6%形变率(b组):0.4621±0.0120;(3)12%形变率(c组):0.5423±0.0148;(4)18%形变率(d组):0.4511±0.0369;(5)22%形变率(e组):0.3623±0.0324。各实验组与对照组之间成骨细胞吸光度值有统计学差异(p0.01)。6%、12%、18%实验组细胞增殖能力较0%对照组(a组)增强,但以12%形变率的c组细胞增殖最为显著(p0.01),22%形变率的e组od值小于0%对照组(a组),抑制细胞的增殖(p0.01)。因此,我们认为c组12%形变率为促进成骨细胞增殖的最适力值(如图4,表1)。2总rna纯度及完整性鉴定1)紫外分光光度计检测显示:a、c两组细胞总rna的od260/od280比值均在1.9~2.1之间,纯度及浓度符合实验要求。2)凝胶电泳结果显示:a、c两组样本提取的mrna经1%琼脂糖凝胶电泳后可见三个条带出现,且第一条带(28s)亮度约为第二条(18s)的两倍,最下面一条(5s)最淡,说明a、c两组样本提取的rna完整性较好。3基因表达谱结果:12%形变率的周期性张应力(c组)加载成骨细胞24h后,与对照组(a组)相比,2倍以上变化的差异表达基因有722个,其中560个表达上调,162个表达下调,与细胞增殖分化相关的差异基因主要有rho、sost、wnt3a、bmp4、mapk10、mapk3,分别为对照组的2.35、-2.37、2.15、3.19、2.71、2.53倍,其所在的bmp/smads信号通路、wnt信号通路和mapk信号通路参与了力学诱导下细胞增殖分化的过程。结论:1适当的张应力在一定加力时间条件下,可促进成骨细胞的增殖活性,力值过大会抑制细胞的增殖。2适当的张应力加载成骨细胞后,基因的表达发生改变,细胞增殖分化相关的差异基因Rho、Wnt3a、BMP4、MAPK10和MAPK3的表达上调,SOST的表达下调。3 SOST、Wnt3a、BMP4、Rho、MAPK10和MAPK3基因可通过与成骨相关的Wnt、BMP/smads、MAPK三条信号通路来调控力学刺激诱导下成骨细胞的增殖分化过程。
【关键词】：周期性张应力 成骨细胞 增殖 基因芯片 MTT法
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R783.5
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文缩写11-13
• 前言13-15
• 材料与方法15-24
• 结果24-25
• 附图25-32
• 附表32-41
• 讨论41-46
• 结论46-47
• 参考文献47-53
• 综述 应力刺激对成骨细胞作用的相关研究53-66
• 参考文献60-66
• 致谢66-67
• 个人简历67

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