NSun2基因敲除的小鼠胚胎干细胞系和小鼠模型的建立及基因功能的初步研究

发布时间：2017-04-27 11:05

  本文关键词：NSun2基因敲除的小鼠胚胎干细胞系和小鼠模型的建立及基因功能的初步研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：胚胎干细胞(Embryonic stem cell, ESC)取自于着床前的囊胚内细胞团,具有无限增殖的自我更新能力和分化为包括生殖系在内的机体全部类型组织细胞的全能性。在一定的体外培养条件下,胚胎干细胞可以分化为心肌细胞、胰岛p细胞、神经细胞等多种类型的体细胞。胚胎干细胞全能性的特点,使其不仅为研究机体的发育机制和基因功能提供了良好的平台,也在细胞替代治疗等新兴疾病治疗手段中具有广阔的应用前景。哺乳动物在生物进化程度上更加接近于人类,是研究基因功能和疾病致病机理的良好模型。哺乳动物疾病模型,如啮齿类的小鼠、大鼠疾病模型,猪的疾病模型和非人灵长类的猴子模型等,在对基因的功能和作用机制的探索、新药研发及人类疾病的发病机理的研究和治疗等方面发挥着非常重要的作用。要获得遗传修饰的哺乳动物疾病模型需要同时具备以下两个因素：一方面是对遗传物质基因组DNA进行遗传修饰,常见的技术包括物理、化学和病毒或者质粒介导的随机插入、转座子系统介导的基因捕获、同源重组和位点特异性核酸内切酶介导的基因编辑等；二是将遗传修饰拓展到个体水平并能够通过生殖系传递到下一代,常见的技术包括胚胎原核注射、体细胞核移植、胚胎干细胞介导的生殖系嵌合以及单倍体胚胎干细胞替代精子与卵母细胞融合产生个体等。近几年发展起来的位点特异性核酸酶介导的基因编辑技术,是一种定向改造基因组的遗传修饰技术,是进行基因组改造和探索基因功能的关键技术手段之一。目前常用的基因编辑技术主要包括ZFN (Zinc-finger nucleases)、TALEN (Transcription activator-like effector nucleases)和CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas9。其中CRISPR-Cas9技术由于构建简单、使用方便、周期短、基因编辑效率高而且价格便宜,已经被广泛应用于基因修饰的干细胞系的建立和哺乳动物疾病模型的获得。其主要原理是通过gRNA利用碱基互补配对靶向目的位点,引导Cas9在该位点进行切割从而产生DNA双链断裂(Double strand break, DSB),进而诱发内源性的细胞修复机制,通过同源重组修复(Homologous directed repair, HDR)或非同源末端连接(Non-homologousend-joining NHEJ)将断裂的双链DNA连接起来,通过不同的修复方式以及利用设计好的带有同源区段的供体质粒或寡核苷酸片段,就可以实现基因敲除、外源基因或片段的定点插入、基因特定位点的定点突变以及染色体的大片段缺失和重排等遗传修饰。根据文献报道,NSun2基因是一种RNA甲基化转移酶,能够在tRNA的胞嘧啶第5位的C原子上进行甲基化修饰(5mC),促进tRNA的稳定性和蛋白质的生物合成,并能够抑制Myc基因诱导的肿瘤增殖,对精子发生也具有非常重要的作用。另有报道称NSun2基因异常会产生常染色体隐性的智力障碍。MRNA的甲基化修饰主要发生在腺苷酸第6位的N原子上(m6A),m6A修饰对mRNA的剪切,稳定性,细胞内的定位,翻译等具有非常重要的作用。因而我们推测mRNA的m5C修饰也可能具有非常类似的功能,研究NSun2对mRNA的5mC甲基化修饰的作用将有助于我们弄清楚NSun2基因发挥功能的分子机制。为此我们利用CRISPR技术建立了NSun2基因纯合敲除的胚胎干细胞(ESC)和小鼠动物模型,为后续的基因功能和分子机制的的探索、胚胎干细胞的重编程以及对小鼠的发育和代谢等研究提供了基础。
【关键词】：CRISPR 疾病模型 胚胎干细胞 NSun2 RNA甲基化
【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 符号说明9-12
• 第一章 文献综述12-26
• 1.1 胚胎干细胞研究进展12-13
• 1.1.1 胚胎干细胞的获得和应用12
• 1.1.2 体细胞重编程为干细胞12-13
• 1.2 遗传修饰技术在哺乳动物疾病模型建立中的研究进展13-22
• 1.2.1 传统的遗传修饰技术14-15
• 1.2.2 基因编辑技术15-22
• 1.3 RNA甲基化和NSun2基因功能研究进展22-25
• 1.3.1 m6A的研究进展22-24
• 1.3.2 NSun2基因功能研究进展24-25
• 1.4 本研究的目的和意义25-26
• 第二章 NSun2基因敲除小鼠胚胎干细胞系的建立和功能的初步研究26-46
• 2.1 材料和方法26-38
• 2.1.1 主要溶液配制26
• 2.1.2 主要仪器与设备26-27
• 2.1.3 主要试剂和耗材27-28
• 2.1.4 小鼠胚胎干细胞系的建立28-30
• 2.1.5 NSun2基因敲除打靶策略30
• 2.1.6 NSun2基因打靶质粒的构建和获得30-33
• 2.1.7 筛选高效的sgRNA33
• 2.1.8 NSun2基因打靶质粒转染胚胎干细胞33-34
• 2.1.9 流式细胞仪分选34
• 2.1.10 挑取单克隆细胞系34
• 2.1.11 NSun2基因敲除胚胎干细胞基因型鉴定34-36
• 2.1.12 NSun2基因敲除的胚胎干细胞Western blot鉴定36-37
• 2.1.13 NSun2基因敲除的胚胎干细胞系表型分析37-38
• 2.2 结果及分析38-43
• 2.2.1 NSun2基因敲除的胚胎干细胞系的建立38-39
• 2.2.2 NSun2基因敲除的胚胎干细胞系基因型鉴定结果39-40
• 2.2.3 NSun2基因敲除的胚胎干细胞系Western Blot鉴定结果40-41
• 2.2.4 NSun2基因敲除的胚胎干细胞系表型分析结果41-43
• 2.3 讨论43-45
• 2.4 结论45-46
• 第三章 建立NSun2基因敲除的小鼠模型46-58
• 3.1 材料与方法46-51
• 3.1.1 主要溶液配制46
• 3.1.2 主要仪器与设备46
• 3.1.3 主要试剂与耗材46
• 3.1.4 实验动物46
• 3.1.5 NSun2基因敲除打靶策略46-47
• 3.1.6 NSun2基因打靶质粒的构建和获得47
• 3.1.7 体外转录Cas9和sgRNA47-49
• 3.1.8 胚胎胞质注射获得F0代founder鼠49
• 3.1.9 F1代NSun2基因杂合敲除小鼠的获得49-50
• 3.1.10 F2代NSun2基因纯合敲除小鼠的获得50-51
• 3.2 结果与分析51-56
• 3.2.1 获得注射用的Cas9 RNA和sgRNA51
• 3.2.2 F0代founder鼠的获得和基因型鉴定51-52
• 3.2.3 F1代NSun2基因敲除小鼠的获得和基因型鉴定52
• 3.2.4 F2代NSun2基因敲除小鼠的获得和基因型鉴定52-53
• 3.2.5 F2代NSun2基因敲除小鼠Western Blot鉴定53-54
• 3.2.6 NSun2基因敲除小鼠的表型54-56
• 3.3 讨论56-57
• 3.4 结论57-58
• 参考文献58-63
• 附录63-71
• 致谢71-72
• 攻读学位期间发表论文72

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本文编号：330481