灰葡萄孢致病缺陷突变体库的建立及BcATM1基因的致病功能研究

发布时间：2017-04-27 13:09

  本文关键词：灰葡萄孢致病缺陷突变体库的建立及BcATM1基因的致病功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：灰霉病(gray mold)是农业生产中常见的真菌病害,以双子叶植物为主,可在200多种植物上发生,在果蔬保护地生产中,灰霉病已经成为主要病害,据报道,世界上每年因该病导致的经济损失高达100-1000亿美元。该病害的病原菌为灰葡萄孢(Botrytis cinerea),属于子囊菌门(Ascomycota)真菌。灰葡萄孢是典型的死体营养型病原真菌,研究表明,灰葡萄孢可产生多种致病因子参与致病过程,主要包括细胞壁降解酶类、角质酶、毒素、植物激素、抵抗寄主反应的酶类、小RNA及小分子物质等。但是,对灰葡萄孢侵染植物的致病机制仍研究很少,对该领域进行深入研究,鉴定灰葡萄孢致病相关基因,不仅有助于揭示灰葡萄孢这种死体营养型病原真菌致病的分子机制,还有可能从中发现可以作为杀真菌剂作用靶标的蛋白因子,为开发防治灰霉病及其它类似病害的高效药剂奠定理论和技术基础。本论文采用正向遗传学研究策略,在优化转化方法提高转化效率至80-100/105个分生孢子基础上,利用农杆菌介导的遗传转化方法(ATMT),构建了一个包含12000个转化子的T-DNA随机插入群体,并采用离体叶片接种法,对其进行致病力检测,从中筛选出了463个致病力发生异常的突变体。通过southern blot检测,该突变体库中T-DNA随机插入灰葡萄孢基因组的单拷贝率达到了53.8%,这为后续实验中大规模鉴定灰葡萄孢致病相关基因提供了坚实的基础。通过侵染不同的寄主植物,本论文还筛选到了23个突变体具有寄主侵染特异性。基于对上述突变体库的T-DNA插入位点分析,筛选到一株致病力缺陷突变体,其T-DNA插在ATM1同源基因终止密码子下游169bp处,将该基因命名为Bc ATM1。Atm1是一类在真核生物中进化保守的线粒体内膜ABC转运蛋白,在维持细胞正常生命过程中发挥重要的作用,但Atm1在病原菌致病过程的作用至今仍不清楚。本研究为了验证其功能,通过反向遗传学策略,采用同源替换的方法对该基因实施了定点敲除。表型分析发现,突变体ΔBcatm1的分生孢子萌发缓慢且不同步,菌丝生长速度也显著慢于野生型;离体叶片接种实验显示,突变体ΔBcatm1基本丧失了致病能力,在侵入寄主细胞后,只能在接种点附近引发微小的病斑,但不扩展。将完整的Bc ATM1基因重新导入突变体ΔBcatm1可以完全或部分恢复上述异常表型。表明Bc ATM1是一个关键的致病相关基因,参与了灰葡萄孢分生孢子的萌发、菌丝生长及侵染寄主等过程。
【关键词】：灰葡萄孢 农杆菌介导的遗传转化 突变体库 ABC转运蛋白 致病力
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S432.44
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 第一章 文献综述12-18
• 1.1 植物灰霉病与灰葡萄孢12-15
• 1.1.1 植物灰霉病12-13
• 1.1.2 灰葡萄孢生物学分类13
• 1.1.3 灰葡萄孢的侵染循环13-14
• 1.1.4 灰葡萄孢的侵染途径14-15
• 1.2 灰葡萄孢致病功能基因组学研究进展15-16
• 1.3 ABC-转运蛋白的研究现状16-17
• 1.4 目的和意义17-18
• 第二章 灰葡萄孢突变体库的建立18-44
• 2.1 实验材料18-22
• 2.1.1 供试菌株18
• 2.1.2 植物材料18
• 2.1.3 供试载体18
• 2.1.4 主要仪器和设备18-19
• 2.1.5 实验药品及试剂19
• 2.1.6 培养基19-21
• 2.1.7 引物21-22
• 2.2 实验方法22-36
• 2.2.1 基因组DNA提取22-24
• 2.2.2 PCR反应24-26
• 2.2.3 酶切反应26
• 2.2.4 农杆菌感受态的制备与转化26-27
• 2.2.5 双元载体pBHt2转化27
• 2.2.6 农杆菌介导的灰葡萄孢T-DNA随机插入转化子群体的建立27-29
• 2.2.7 灰葡萄孢致病缺陷突变体库的建立29-31
• 2.2.8 灰葡萄孢致病缺陷突变体库的评价31-35
• 2.2.9 T-DNA插入位点的克隆35-36
• 2.3 结果与分析36-44
• 2.3.1 农杆菌介导的灰葡萄孢T-DNA随机插入转化子群体的建立36-37
• 2.3.2 灰葡萄孢致病缺陷突变体库的构建37-38
• 2.3.3 灰葡萄孢致病力缺陷突变体的寄主特异性检测38-39
• 2.3.4 灰葡萄孢致病缺陷突变体库的质量评价39-41
• 2.3.5 灰葡萄孢突变体T-DNA插入位点鉴定41-44
• 第三章 灰葡萄孢ABC转运蛋白基因BcATM1的功能分析44-61
• 3.1 实验材料44-46
• 3.1.1 供试菌株44
• 3.1.2 植物材料44
• 3.1.3 供试载体44
• 3.1.4 转化子筛选培养基44-45
• 3.1.5 引物45-46
• 3.2 实验方法46-54
• 3.2.1 质粒DNA提取46-47
• 3.2.2 连接反应47
• 3.2.3 重组反应47-48
• 3.2.4 大肠杆菌感受态的制备和转化48-49
• 3.2.5 目的基因的序列分析49-50
• 3.2.6 基因缺失突变体的构建50-51
• 3.2.7 基因互补突变体的构建51-53
• 3.2.8 突变体鉴定53
• 3.2.9 目的基因的生物功能分析53-54
• 3.3 结果与分析54-61
• 3.3.1 致病相关基因BcATM1的鉴定及特征分析54-55
• 3.3.2 BcATM1基因的敲除载体的构建55-56
• 3.3.3 BcATM1基因的互补载体的构建56-57
• 3.3.4 BcATM1的突变体的分子鉴定57-58
• 3.3.5 BcATM1基因参与灰葡萄孢孢子萌发以及菌丝生长分析58-59
• 3.3.6 BcATM1基因参与灰葡萄孢侵染寄主植物分析59-61
• 第四章 结论61-63
• 展望63-64
• 参考文献64-67
• 作者简介67-68
• 致谢68-69

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  本文关键词：灰葡萄孢致病缺陷突变体库的建立及BcATM1基因的致病功能研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：330670