弓形虫ROP46基因缺失虫株构建及其生物学特性分析

发布时间：2017-04-28 00:01

  本文关键词：弓形虫ROP46基因缺失虫株构建及其生物学特性分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：棒状体蛋白(ROPs)是弓形虫侵入宿主细胞的重要分泌蛋白,参与纳虫空泡膜的形成、调控宿主细胞基因表达、调节虫株毒力以及宿主细胞与弓形虫之间相互作用。在弓形虫急性感染和慢性感染以及不同毒力弓形虫入侵细胞时,ROP46蛋白表达量差异显著。因此对ROP46蛋白的研究,可为弓形虫速殖子向缓殖子转化机制的研究提供参考,也为防治弓形虫病药物的研制奠定基础。采用PCR技术扩增ROP46基因,并克隆至原核蛋白表达载体,诱导ROP46蛋白表达。通过ELISA方法检测ROP46与弓形虫阳性血清的反应。采用CRISPR/Cas9技术,设计ROP46 gRNA,构建ROP46基因敲除重组质粒,经过药物筛选、终点稀释法和荧光显微镜筛选敲除虫株,纯化ROP46基因缺失虫株。利用流式细胞术和荧光显微镜计数法对ROP46基因缺失虫株的生长特性进行检测和分析。将野生虫株和ROP46基因敲除虫株感染小白鼠,观察两种弓形虫的毒力差异。PCR扩增的ROP46基因成功克隆至蛋白表达载体并表达,ELISA检测结果显示,ROP46蛋白与弓形虫血清呈阳性反应。对ROP46基因敲除虫株进行序列分析,测序结果显示,ROP46基因的195到277位点均缺失了82个碱基,且该区域为ROP46蛋白激酶功能区,证明应用CRISPR/Cas9技术构建的敲除重组质粒成功的敲除了弓形虫PLK虫株的目的基因,并获得了ROP46基因缺失虫株T.gondii/△ROP46。流式细胞术和计数法的结果显示,ROP46基因缺失虫株的侵入和复制效率显著降低。动物实验表明,与感染NC对照虫株的小白鼠相比,感染ROP46基因敲除虫株的小白鼠的存活时间较长,证明ROP46对弓形虫的毒力有一定的影响。本研究采用CRISPR/Cas9技术,成功获得可以稳定遗传的ROP46基因缺失虫株T.gondii/△ROP46,并证实ROP46显著抑制弓形虫侵入复制能力及毒力。
【关键词】：ROP46 CRISPR/Cas9 弓形虫 棒状体
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.7
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 第一章 文献综述9-21
• 1.1 棒状体9-17
• 1.1.1 概述9-10
• 1.1.2 棒状体组成10-11
• 1.1.3 棒状体蛋白的生物信息学11-12
• 1.1.4 棒状体颈部蛋白和移动复合体12-13
• 1.1.5 后基因组时代对棒状体蛋白的分析13
• 1.1.6 弓形虫棒状体蛋白质组的特征。13-14
• 1.1.7 已知重要的棒状体蛋白14-17
• 1.2 CRISPR/Cas9技术17-19
• 1.2.1 CRISPR/Cas系统研究历程17-18
• 1.2.2 CRISPR/Cas9系统结构与分类18
• 1.2.3 CRISPR/Cas9的作用机理18-19
• 1.3 研究目的与意义19-21
• 第二章 ROP46与弓形虫阳性血清ELISA反应21-33
• 2.1 实验材料21-22
• 2.1.1 菌株和质粒21
• 2.1.2 实验主要试剂21
• 2.1.3 主要设备仪器21
• 2.1.4 主要溶液及培养基的配制21-22
• 2.2 实验方法22-28
• 2.2.1 ROP46蛋白表达22-27
• 2.2.3 ROP46原核表达和纯化27-28
• 2.2.4 ELISA检测ROP46蛋白28
• 2.3 实验结果28-31
• 2.3.1 弓形虫ROP46基因扩增28-29
• 2.3.2 ROP46表达载体酶切鉴定29-30
• 2.3.3 ROP46在大肠杆菌中的表达30
• 2.3.4 ELISA检测结果30-31
• 2.4 讨论31-32
• 2.5 小结32-33
• 第三章 弓形虫Rop46基因的敲除及鉴定33-43
• 3.1 实验材料33
• 3.1.1 菌株和质粒33
• 3.1.2 实验主要试剂33
• 3.2 实验方法33-38
• 3.2.1 Rop46 敲除质粒构建33-35
• 3.2.2 转染35
• 3.2.3 单克隆虫株筛选35-36
• 3.2.4 Rop46敲除虫株鉴定36-38
• 3.3 实验结果38-40
• 3.3.1 Rop46敲除质粒pCD-Rop46的构建38-39
• 3.3.2 Rop46敲除虫株的制备39
• 3.3.3 Rop46敲除虫株的初步鉴定39-40
• 3.3.4 Rop46基因缺失虫株的鉴定40
• 3.4 讨论40-41
• 3.5 小结41-43
• 第四章 Rop46基因敲除虫株对PLK侵入和复制的影响43-49
• 4.1 实验材料43
• 4.1.1 菌株和细胞43
• 4.2 实验方法43-44
• 4.3 实验结果44-46
• 4.3.1 侵入复制44-45
• 4.3.2 毒力测定45-46
• 4.4 讨论46-47
• 4.5 小结47-49
• 第五章 结论49-51
• 参考文献51-57
• 致谢57-59
• 个人简介59

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