基因剂量及基因突变对β-甘露聚糖酶表达的影响

发布时间：2021-07-23 17:38

　　甘露聚糖酶通过对甘露聚糖类物质的降解,可有效地提高饲料的营养利用率。本研究根据GenBank上黑曲霉（Aspergillu niger）CBS 513.88基因序列,通过毕赤酵母偏好性优化β-甘露聚糖酶基因,人工合成全基因MANsyn,并连接至毕赤酵母表达载体pAO815,构建β-甘露聚糖酶重组表达质粒pAO815-MANsyn,之后成功电转化至毕赤酵母X-33中表达,获得一株酶活最高的菌株,其最适反应温度为70℃,最适pH为5.0,最大酶活能达到450 U/mL。反应体系中加入终浓度为5 mM/L的Mg²⁺能使该β-甘露聚糖酶的酶活大幅提高126%。随后,本研究成功利用同尾酶法构建了β-甘露聚糖酶二拷贝、三拷贝、四拷贝重组表达质粒,并成功电转化至毕赤酵母中表达,二拷贝的酵母菌株酶活能达到539 U/mL,较单拷贝酵母菌株提高了20%,三拷贝的酵母菌株酶活能达到605U/mL,较单拷贝酵母菌株提高了34%,四拷贝的酵母菌株酶活能达到710 U/mL,较单拷贝酵母菌株提高了58%。本研究进一步设计了β-甘露聚糖酶单点突变基因,并连接至赤酵母表达载体pAO815上,电... 

【文章来源】：武汉轻工大学湖北省

【文章页数】：75 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

β-甘露聚糖酶的作用方式

转录可以形成包含相同拷贝数的较长的 mRNA，并且翻译基因的多个同时翻译可以增加目标产物的表达。由于小片段所构太长，因此不会对宿主细胞造成太大的负担，因此常常将感兴趣应用于小片段[39]。Gittins 等[40]研究了红色荧光蛋白(amilFP597)瑚礁基因拷贝数的关系。结果表明，增加 amilFP597 基因的拷贝瑚颜色的动态范围扩大，并完成进一步的实验证实。这一结果是 amilFP597 的转录水平来实现的。

图 1-3 表达盒的多拷贝表达载体Fig.1-3 Multiple-copy of expression cassette in an expression v动子的多拷贝因的多个拷贝和多个表达盒的拷贝不同，启动子多拷达的新方法。该方法是在表达载体中将多个相同的启的表达量提高(如图 1-3)。虽然很多研究已经证明该方法的原理机制尚不明确。Li 等[43]利用 Gibson[44]方法动子在荧光蛋白基因的上游，实验结果表明，荧光蛋动子拷贝数成正比。Kanamasa 等[45]将 12 个 region Ⅲ表达载体上，用于增强 β-甘露聚糖酶在棘孢曲霉中的重组菌株表达量比单拷贝的重组菌株表达量提高了 9克服了长靶基因的问题。 在实验中，我们只需要连源蛋白的表达。

【参考文献】：
期刊论文
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硕士论文
[1]β-甘露聚糖酶发酵条件的优化、酶的纯化和性质研究[D]. 刘祖艳.东北林业大学 2014
[2]利用Biobrick法构建解脂耶氏酵母多拷贝整合载体及基因剂量效应的研究[D]. 张玲.湖北大学 2012
[3]β-甘露聚糖酶基因的克隆、表达及酶学性质研究[D]. 胡文波.河南师范大学 2012
[4]肽抗生素hPAB-β多拷贝串联体的设计、表达与纯化[D]. 胡金川.第三军医大学 2004



本文编号：3299738