拟南芥中新型荧光比率定量基因编码钙指示剂的开发

发布时间：2021-07-24 11:52

　　钙信号是植物生长发育和响应环境变化过程中的核心传感器和调节器。而我们对钙信号传导潜在机制的理解以及对其参与细胞众多进程的认识,很大程度上依赖于钙指示剂的发展。因此,高空间分辨率和时间分辨率的钙指示剂对于监测钙动态变化具有非常重要的意义。在本研究中,我们以植物钙信号研究中最新的超灵敏钙指示剂GCaMP6S为基础,将其进一步优化。通过将GCaMP6S与不同信号肽融合,同时利用能够在后代中能够稳定高效表达且不容易出现基因沉默现象的UBIQUITIN10（UBQ10）作为启动子驱动表达,我们构建了一系列能够进行亚细胞定位的原生质体瞬时表达载体以及能够在模式植物拟南芥中稳定表达的植物表达载体。借助引入钙离子（Ca2+）非敏感性蛋白的dTomato作为定量蛋白,我们开发出了能够进行钙离子定量成像的荧光比率型指示剂GCaMP6S-dTomato。为了能够在植株水平或组织器官水平研究钙信号相关事件,我们获得了一系列超灵敏钙指示剂的转基因植物。前人的研究表明,硝酸盐能够诱导拟南芥胞质中钙离子浓度快速升高,因此利用该已知信号,我们证明了融合了红色荧光蛋白的比率型指示剂GCaMP6S-dTomato具有与G... 

【文章来源】：福建农林大学福建省

【文章页数】：66 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图３－１基于荧光强度的瞬时表达载体构建图谱??基于荧光强度的瞬时表达载体：该图中灰色箭头表示川启动子，绿色方块表示超灵敏??

精度上精确监测植物细胞中钙离子浓度的动态变化。基于荧光共振能量转移的比??率型Ｃａ２＋指示剂ｃａｍｅｌｏｎ系列由于自身的不足，限制了其在植物中的深入应用。??因此我们尝试进一步优化基于ＧＣａＭＰ６Ｓ的超灵敏钙指示剂，如图３－２所示，通??过融合钙离子不敏感蛋白ｄＴｏｍａｔｏ，测量绿色和红色荧光的比率即可定量细胞内??钙离子浓度。即使低钙离子浓度或无钙离子的情况下，我们仍然可以检测到红色??荧光，这将有助于研究者对钙离子变化有更细微且精确的了解，进一步探入对钙??信号分子机制的破解。???１?ＵＢ〇１〇Ｖ￣?ＧＣａＭＰ６Ｓ?八?ｄＴｏｍａｔｏ?ｎｏｓ〉???１?ＮＬＳ?｜???｜ＵＢＱ１Ｑ＾￣?ＧＣａＭＰ６Ｓ?Ｉｔ?ｄＴｏｍａｔｏ?ｔ????ｐＭ，?｜?Ｌｉｎｋｅ）?｜??Ｉ?ＴＰ?Ｉ??图３－２基于荧光比率的瞬时表达载体构建图谱??基于荧光强度的瞬时表达载体：该图中灰色箭头表示启动子，绿??色方块表示超灵敏钙指示剂ＧＣａＭＰ６Ｓ，紫色箭头表示ｎｏｓ终止子，蓝色小方块表示连接两??个荧光蛋白的接头序列

ＰＧ／／５－Ｐ３５＆Ｌ／Ｃ－ＭＷ？连接通过农杆菌侵染的方法导入到拟南芥基因??组ＤＮＡ中，再通过该植物表达载体赋予植物的相应抗性筛选得到纯合转基因植??物。构建的植物双元表达载体的简易图谱如


本文编号：3300601