CRISPR基因编辑相关新技术的优化与完善研究
发布时间：2021-07-24 21:41
CRISPR系统已经成为生物研究中不可或缺的工具之一。至今为止,CRISPR-Cas9不再仅仅是一种基因编辑工具,它的应用领域范围扩展到基因调控、表观遗传编辑、染色质工程和成像等方面,已远远超过了野生型（WT）Cas9本身的基因编辑功能。CRISPR相关新技术的开发和应用将是未来研究的热点问题。本研究主要是应用CRISPR/Cas9系统相关新技术在小鼠细胞、胚胎及人的胚胎中对靶基因进行基因编辑,从而探讨这些新技术是否能安全、有效的应用于遗传疾病治疗。首先,本研究通过在小鼠细胞中比较CasRx系统抑制NHEJ途径重要因子Lig4并结合CRISPR/Cas9系统及Cas9-ORF52蛋白（Kaposi肉瘤相关疱疹ORF52蛋白）共表达这两种策略对同源重组效率的影响,证明这两种方法均能显著的提高同源重组的效率,为在临床疾病治疗中实现需要定向碱基插入或靶向点突变的精确基因组编辑应用提供了新的策略。其次,应用BE3碱基编辑系统,即Crispr-stop新技术对小鼠体内3个基因单独或同时进行敲除,旨在可以在F0代中产生直接用于分析的单个或三个纯合突变小鼠,避免繁琐的小鼠繁殖过程并能使研究小鼠基因功...
【文章来源】：广西大学广西壮族自治区 211工程院校
【文章页数】：143 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
基于CRYSPR-CAS技术的基因组编辑技术主要应用领域[62]
隦NA。该研究证明，能够在这些转基因小鼠中使用内源性神经原性基因的靶向激活，以直接和有效地将星形胶质细胞转化为体内功能性神经元。该系统提供灵活，快速的筛选平台，用于研究哺乳动物大脑中的复杂基因网络和功能获得表型[127]。诱导内源基因座的表达与外源表达相比具有许多优点。对来自靶基因座的基因表达动力学的精确空间和时间控制具有很大的治疗潜力。CRISPR方法的灵活性使研究人员能够采用各种方法来实现这一目标。通过光遗传学和小分子靶向的诱导型CRISPR是CRISPR介导的基因表达方法中更显着的进步之一[128-131]。图1-3通过CRISPR-CAS系统招募DNA和染色质靶向和修饰酶的主要策略[62]Fig.1-3MajorstrategiestorecruitDNA-andchromatin-targetingandmodifyingenzymesviatheCRISPR-Cassystem.1.6.3CRISPR介导的表观基因组编辑的发展与应用CRISPR-Cas9系统作为有效的基因编辑系统后，研究人员便开始利用dCas9融合各种表观遗传学因子对特定基因进行表观遗传学方面的修饰。目前来讲，“表观遗传学”的定义还是一个有争议的问题。在这里，我们使用“表观遗传”这个词来暗示可遗传基因表达变化的分子机制，这种变化不能归因于DNA序列的变化。与表观机制的表观遗传学不同，表观基因组描述了与基因组中调控元件相关的所有翻译后修饰和其他染色质特征。最近的大规模表观基因组学研究，如ENCODE和REMC已经在各种细胞系以及原代细胞类型和组织中对基因组DNA和组蛋白上的染色质修饰进行了定位[132,133]。尽
广西大学博士学位论文CRISPR基因编辑相关新技术的优化与完善研究31图2-2小鼠Actb、Tubb3位点测序图Figure2-2.GenotypinganalysisofcellsatActb、Tubb3lociinN2AandE14cells将小鼠细胞进行消化收集，使用血液、组织、细胞基因组提取试剂盒（天根）抽取基因组，具体步骤如下：将小鼠N2A细胞消化制成细胞悬液，然后12000rpm离心1min，用移液枪吸取上清，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底悬浮；加入20μlProteinaseK溶液置水浴锅56℃反应30min；之后加入200μlGB缓冲液，混匀后放入70℃水浴10min，直至溶液应变清亮为止短暂离心数秒；加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec短暂离心数秒以去除管盖内壁的水珠后，将溶液全部倒入一个吸附柱CB3中，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；加入500μl缓冲液GD，12000rpm离心30sec，丢弃废液，将吸附柱CB3放入收集管中；向吸附柱CB3中加入500μlPW漂洗液，12,000rpm离心30sec，丢弃废液后，将吸附柱CB3放入收集管中，再重复此步骤一次；将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，使收集管中残余的漂洗液挥发；将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μlddH2O，室温放置2min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中并进行定量。然后使用TAKALAPremixExTaqPCR分别检测插入的Actb、Tubb3位点，然后使用PCR产物直接测序。PCR引物见附录1。PCR组分如下：表2-9小鼠基因型检测PCR组分Table2-9ThePCRcomponentsformousegenotyping试剂使用量PremixTaq基因组DNAPrimerActborTubb3AF/BF（10μm）PrimerActborTubb3AR/BR（10μm）ddH2OTotal12.5μl1μl1μl1μl11.5μl25μl巣式反应第一轮：95
本文编号：3301480
【文章来源】：广西大学广西壮族自治区 211工程院校
【文章页数】：143 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
基于CRYSPR-CAS技术的基因组编辑技术主要应用领域[62]
隦NA。该研究证明，能够在这些转基因小鼠中使用内源性神经原性基因的靶向激活，以直接和有效地将星形胶质细胞转化为体内功能性神经元。该系统提供灵活，快速的筛选平台，用于研究哺乳动物大脑中的复杂基因网络和功能获得表型[127]。诱导内源基因座的表达与外源表达相比具有许多优点。对来自靶基因座的基因表达动力学的精确空间和时间控制具有很大的治疗潜力。CRISPR方法的灵活性使研究人员能够采用各种方法来实现这一目标。通过光遗传学和小分子靶向的诱导型CRISPR是CRISPR介导的基因表达方法中更显着的进步之一[128-131]。图1-3通过CRISPR-CAS系统招募DNA和染色质靶向和修饰酶的主要策略[62]Fig.1-3MajorstrategiestorecruitDNA-andchromatin-targetingandmodifyingenzymesviatheCRISPR-Cassystem.1.6.3CRISPR介导的表观基因组编辑的发展与应用CRISPR-Cas9系统作为有效的基因编辑系统后，研究人员便开始利用dCas9融合各种表观遗传学因子对特定基因进行表观遗传学方面的修饰。目前来讲，“表观遗传学”的定义还是一个有争议的问题。在这里，我们使用“表观遗传”这个词来暗示可遗传基因表达变化的分子机制，这种变化不能归因于DNA序列的变化。与表观机制的表观遗传学不同，表观基因组描述了与基因组中调控元件相关的所有翻译后修饰和其他染色质特征。最近的大规模表观基因组学研究，如ENCODE和REMC已经在各种细胞系以及原代细胞类型和组织中对基因组DNA和组蛋白上的染色质修饰进行了定位[132,133]。尽
广西大学博士学位论文CRISPR基因编辑相关新技术的优化与完善研究31图2-2小鼠Actb、Tubb3位点测序图Figure2-2.GenotypinganalysisofcellsatActb、Tubb3lociinN2AandE14cells将小鼠细胞进行消化收集，使用血液、组织、细胞基因组提取试剂盒（天根）抽取基因组，具体步骤如下：将小鼠N2A细胞消化制成细胞悬液，然后12000rpm离心1min，用移液枪吸取上清，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底悬浮；加入20μlProteinaseK溶液置水浴锅56℃反应30min；之后加入200μlGB缓冲液，混匀后放入70℃水浴10min，直至溶液应变清亮为止短暂离心数秒；加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec短暂离心数秒以去除管盖内壁的水珠后，将溶液全部倒入一个吸附柱CB3中，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；加入500μl缓冲液GD，12000rpm离心30sec，丢弃废液，将吸附柱CB3放入收集管中；向吸附柱CB3中加入500μlPW漂洗液，12,000rpm离心30sec，丢弃废液后，将吸附柱CB3放入收集管中，再重复此步骤一次；将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，使收集管中残余的漂洗液挥发；将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μlddH2O，室温放置2min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中并进行定量。然后使用TAKALAPremixExTaqPCR分别检测插入的Actb、Tubb3位点，然后使用PCR产物直接测序。PCR引物见附录1。PCR组分如下：表2-9小鼠基因型检测PCR组分Table2-9ThePCRcomponentsformousegenotyping试剂使用量PremixTaq基因组DNAPrimerActborTubb3AF/BF（10μm）PrimerActborTubb3AR/BR（10μm）ddH2OTotal12.5μl1μl1μl1μl11.5μl25μl巣式反应第一轮：95
本文编号：3301480
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