环果寡糖糖基转移酶基因异源表达和改造
发布时间：2021-07-29 09:15
环果寡糖糖基转移酶（Cycloinulooligosaccharide fructanotransferase,CFTase）是糖苷水解酶家族的一员（Glycoside Hydrolase Family32,GH32）,可以通过催化菊粉分子内的转糖基反应产生一系列的环果寡糖,其中以6个D-呋喃果糖单元通过β-（2,1）-糖苷键连接而成的环状低聚果糖（Cycloinulohexaose,CF6）为主。目前,关于CFTase的研究停留在对酶进行分离纯化和酶学性质表征,而对其催化菊粉产生不同产物的作用机制研究相对较少。本实验室有源于类芽孢杆菌Paenibacillus sp.Lfos16表达的CFTase106,采用P.pastoris X-33表达宿主对其进行异源表达,并与实验室前期构建的E.coli BL21（DE3）重组表达CFTase106比较。结果表明不同表达宿主来源的重组CFTase106的酶学性质没有显著差异。考虑到大肠杆菌易于培养,且生产周期短,可以用于快速评估实验结果。因此,后续实验将以大肠杆菌作为表达系统进行CFTase106的定向进化和固定化研究。为了研究CFTase1...
【文章来源】：大连工业大学辽宁省
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
菊粉结构示意图
第一章文献综述51.3环果寡糖1.3.1环果寡糖的结构环果寡糖由6~8个果糖通过β-(2→1)糖苷键连接而成的环状化合物（如图1.2）。目前主要的环化产物主要有环果己糖、环果庚糖和环果辛糖。其中，环果己糖的晶体分子式为C36H60O30·3H2O，相对分子质量为1026.9，熔点为231-233°，旋光度为-65°。同时，室温下甲醇水溶液的结晶为无色棱柱状晶体，大小为0.3×0.3×0.3mm，且呈六角晶型，晶胞尺寸a=b=24.688，c=6.477，α=β=90.00°，γ=120.00°，且结构呈现18-crown-6骨架，具有6个-O-C-CH2-O-构成的gtgtgt构象[26,27]。图1.2环果己糖的结构示意Fig.1.2Schematicstructureofthecycloinulo-hexaose1.3.2环果寡糖的应用(1)金属离子络合剂：α-环糊精是由D-葡萄糖通过α-(1,4)-糖苷键形成的环己糖，可以在其疏水性锥形腔内通过疏水相互作用与中性分子结合，而环果寡糖能够通过静电相互作用结合阳离子，表现出对碱性阳离子的选择性，这一发现与α-环糊精的性质形成了鲜明的对比。由于环果己糖在水中具有良好的溶解性，又可作为新型宿主和人工酶的主要骨架化合物，因此在有机合成中受到人们的广泛关注。环果己糖与典型阳离子络合主要是由边缘OMe-3氧的呋喃糖环和冠醚氧，而不是由18-crown-6的氧结合[28,29]。Shizuma[30]对不同甲基化环果寡糖甲基化环己糖（CF6、CF7、CF8）与金属阳离子的络合行为进行了表征。缔合常数（KS）表明CF6和杯芳烃衍生物与金属阳离子的结合能力
稳定性，特别是因其功能和结构的有效性而受到越来越多的关注。各种各样的纳米生物催化载体，包括纳米孔介质、纳米载体、碳纳米管和纳米颗粒，具有较大的比表面积，可以有效地控制酶的纳米尺度环境，因此有望在酶技术的许多领域取得令人兴奋的进展。同时，这些特性为改善酶的生物学功能和扩大其在工业生物催化、生物传感器和生物分析设备等领域的应用提供了新的机会[55]。Yin等[56]以Ca3(PO4)2为无机组分，α-chymotrypsin（ChT）为有机组分合成了杂交纳米花，并系统研究了反应参数对酶包埋纳米花形成的影响及其生长机理（如图1.4）。固定化ChT重复使用8次后，纳米花的残留活性略有下降，其稳定性良好。图1.4杂交纳米化合成示意图[56]Fig.1.4Schematicrepresentationofthesynthesisofhybridnanoflowers[56]酶及其相应金属离子的选择对hNFs的形成和催化活性的增强具有重要作用。变构效应是酶与金属离子适当结合的一个显著例子。在这种现象中，酶的活性是由于效应分子与酶的活性位点结合后，酶的构象发生了良好的变化。Wang等[57]报到了一个CaHPO4-α-amylase纳米生物催化系统。该催化系统中具有三种不同形貌的新型纳米生物催化体系：纳米花、纳米颗粒和平行六面体，揭示了在Ca2+存在下的变构效应和纳米花
【参考文献】：
期刊论文
[1]类芽孢杆菌环果寡糖糖基转移酶的分离纯化和酶学性质[J]. 马俊,刘思敏,唐文竹. 工业微生物. 2019(01)
[2]大肠杆菌表达系统和酵母表达系统的研究进展[J]. 祁浩,刘新利. 安徽农业科学. 2016(17)
[3]环果寡糖果糖基转移酶研究进展[J]. 石方卉,侯英敏,唐文竹. 微生物学杂志. 2016(03)
[4]应用易错PCR技术提高环糊精葡萄糖基转移酶的可溶性表达[J]. 郭永华,陈济琛,贾宪波,陈龙军,蔡海松,林新坚. 微生物学报. 2016(10)
[5]易错PCR法提高土芽孢杆菌ZH1羧酸酯酶的热稳定性[J]. 刘韩,吴丽云,高贺,倪辉,蔡慧农,朱艳冰. 微生物学报. 2015(08)
[6]大肠杆菌和酵母表达系统的研究进展[J]. 张云鹏,温彤,姜伟. 生物技术进展. 2014(06)
[7]易错PCR技术提高枯草芽孢杆菌α-淀粉酶活性研究[J]. 马全磊,沈思军,代蓉,闫云峰,潘晓亮. 饲料研究. 2014(19)
[8]易错PCR提高华根霉脂肪酶的热稳定性[J]. 王睿,喻晓蔚,徐岩. 生物工程学报. 2013(12)
[9]易错PCR技术提高中性内切葡聚糖酶活性[J]. 唐自钟,刘姗,韩学易,姚友旭,刘默洋,陈惠,晋海军,吴琦,单志. 食品与生物技术学报. 2013(07)
[10]基于易错PCR的头孢菌素C酰化酶的定向进化[J]. 王颖秋,郑林冲,谢丽萍,朱宝泉,胡又佳. 中国医药工业杂志. 2013(04)
硕士论文
[1]环果寡糖糖基转移酶基因的异源表达及催化机理研究[D]. 孙晓萌.大连工业大学 2016
[2]一株类芽孢杆菌产环果寡糖糖基转移酶的研究[D]. 张杉.大连工业大学 2016
本文编号：3309055
【文章来源】：大连工业大学辽宁省
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
菊粉结构示意图
第一章文献综述51.3环果寡糖1.3.1环果寡糖的结构环果寡糖由6~8个果糖通过β-(2→1)糖苷键连接而成的环状化合物（如图1.2）。目前主要的环化产物主要有环果己糖、环果庚糖和环果辛糖。其中，环果己糖的晶体分子式为C36H60O30·3H2O，相对分子质量为1026.9，熔点为231-233°，旋光度为-65°。同时，室温下甲醇水溶液的结晶为无色棱柱状晶体，大小为0.3×0.3×0.3mm，且呈六角晶型，晶胞尺寸a=b=24.688，c=6.477，α=β=90.00°，γ=120.00°，且结构呈现18-crown-6骨架，具有6个-O-C-CH2-O-构成的gtgtgt构象[26,27]。图1.2环果己糖的结构示意Fig.1.2Schematicstructureofthecycloinulo-hexaose1.3.2环果寡糖的应用(1)金属离子络合剂：α-环糊精是由D-葡萄糖通过α-(1,4)-糖苷键形成的环己糖，可以在其疏水性锥形腔内通过疏水相互作用与中性分子结合，而环果寡糖能够通过静电相互作用结合阳离子，表现出对碱性阳离子的选择性，这一发现与α-环糊精的性质形成了鲜明的对比。由于环果己糖在水中具有良好的溶解性，又可作为新型宿主和人工酶的主要骨架化合物，因此在有机合成中受到人们的广泛关注。环果己糖与典型阳离子络合主要是由边缘OMe-3氧的呋喃糖环和冠醚氧，而不是由18-crown-6的氧结合[28,29]。Shizuma[30]对不同甲基化环果寡糖甲基化环己糖（CF6、CF7、CF8）与金属阳离子的络合行为进行了表征。缔合常数（KS）表明CF6和杯芳烃衍生物与金属阳离子的结合能力
稳定性，特别是因其功能和结构的有效性而受到越来越多的关注。各种各样的纳米生物催化载体，包括纳米孔介质、纳米载体、碳纳米管和纳米颗粒，具有较大的比表面积，可以有效地控制酶的纳米尺度环境，因此有望在酶技术的许多领域取得令人兴奋的进展。同时，这些特性为改善酶的生物学功能和扩大其在工业生物催化、生物传感器和生物分析设备等领域的应用提供了新的机会[55]。Yin等[56]以Ca3(PO4)2为无机组分，α-chymotrypsin（ChT）为有机组分合成了杂交纳米花，并系统研究了反应参数对酶包埋纳米花形成的影响及其生长机理（如图1.4）。固定化ChT重复使用8次后，纳米花的残留活性略有下降，其稳定性良好。图1.4杂交纳米化合成示意图[56]Fig.1.4Schematicrepresentationofthesynthesisofhybridnanoflowers[56]酶及其相应金属离子的选择对hNFs的形成和催化活性的增强具有重要作用。变构效应是酶与金属离子适当结合的一个显著例子。在这种现象中，酶的活性是由于效应分子与酶的活性位点结合后，酶的构象发生了良好的变化。Wang等[57]报到了一个CaHPO4-α-amylase纳米生物催化系统。该催化系统中具有三种不同形貌的新型纳米生物催化体系：纳米花、纳米颗粒和平行六面体，揭示了在Ca2+存在下的变构效应和纳米花
【参考文献】：
期刊论文
[1]类芽孢杆菌环果寡糖糖基转移酶的分离纯化和酶学性质[J]. 马俊,刘思敏,唐文竹. 工业微生物. 2019(01)
[2]大肠杆菌表达系统和酵母表达系统的研究进展[J]. 祁浩,刘新利. 安徽农业科学. 2016(17)
[3]环果寡糖果糖基转移酶研究进展[J]. 石方卉,侯英敏,唐文竹. 微生物学杂志. 2016(03)
[4]应用易错PCR技术提高环糊精葡萄糖基转移酶的可溶性表达[J]. 郭永华,陈济琛,贾宪波,陈龙军,蔡海松,林新坚. 微生物学报. 2016(10)
[5]易错PCR法提高土芽孢杆菌ZH1羧酸酯酶的热稳定性[J]. 刘韩,吴丽云,高贺,倪辉,蔡慧农,朱艳冰. 微生物学报. 2015(08)
[6]大肠杆菌和酵母表达系统的研究进展[J]. 张云鹏,温彤,姜伟. 生物技术进展. 2014(06)
[7]易错PCR技术提高枯草芽孢杆菌α-淀粉酶活性研究[J]. 马全磊,沈思军,代蓉,闫云峰,潘晓亮. 饲料研究. 2014(19)
[8]易错PCR提高华根霉脂肪酶的热稳定性[J]. 王睿,喻晓蔚,徐岩. 生物工程学报. 2013(12)
[9]易错PCR技术提高中性内切葡聚糖酶活性[J]. 唐自钟,刘姗,韩学易,姚友旭,刘默洋,陈惠,晋海军,吴琦,单志. 食品与生物技术学报. 2013(07)
[10]基于易错PCR的头孢菌素C酰化酶的定向进化[J]. 王颖秋,郑林冲,谢丽萍,朱宝泉,胡又佳. 中国医药工业杂志. 2013(04)
硕士论文
[1]环果寡糖糖基转移酶基因的异源表达及催化机理研究[D]. 孙晓萌.大连工业大学 2016
[2]一株类芽孢杆菌产环果寡糖糖基转移酶的研究[D]. 张杉.大连工业大学 2016
本文编号：3309055
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