BoEMS1和BoDAD基因控制甘蓝雄性不育的功能研究
发布时间：2021-07-28 20:13
结球甘蓝（Brassica oleracea L.var.capitata L.）,简称甘蓝,是十字花科芸薹属甘蓝种中两年生的重要蔬菜作物。甘蓝为典型的异花授粉作物,具有自交不亲和的特点,长期依赖于人工蕾期自交授粉繁殖自交不亲和原种,工作量大,杂交率很难达到100%。进入本世纪以后,甘蓝杂交育种的重点转向了雄性不育系的选育和利用。其中细胞质雄性不育（CMS）的利用最为普遍,存在恢复源限制,胞质负效应、胞质单一化等问题。针对当前甘蓝雄性不育工作中存在的雄性不育遗传资源狭窄,过度利用萝卜Ogura CMS不育源,单一胞质使用的潜在风险以及因严重缺乏优良甘蓝自交亲和系制约了甘蓝雄性不育杂交育种发展和应用等问题,本研究拟通过甘蓝细胞核不育系和自交亲和性系的创制,扩大甘蓝雄性不育资源,规避单一胞质使用风险,促进甘蓝雄性不育杂交育种的发展。随着控制甘蓝雄性不育和自交不亲和性基因明确,以基因组编辑为主的反向遗传学技术可以对目的基因的靶位点进行定点改造,为培育自交亲和的雄性不育系提供了可能。本试验以甘蓝为研究对象,利用RNAi、优化的CRISPR/Cas9等技术,对甘蓝BoEMS1、BoSRK以及Bo...
【文章来源】：西南大学重庆市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：113 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
茉莉酸（JA）生物合成途径Fig.1-1Biosynthesisofjasmonates
进一步分析 CRISPR/Cas 的结构主要如下三个部分：一个 CRISPR 簇，包括一段非常保守的重复序列（repeat）和长度相似的间隔序列（spacer）；CRISPR 簇前端的引导序列（leader sequence）；CRISPR 簇侧翼的一些辅助基因（CRISPRassociated genes，cas），如图 1-2 所示。目前研究发现 CRISPER/Csa9 系统有 3 种，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，由于Ⅰ型和Ⅲ型的工作机制较为复杂，需要复杂的 Cas 蛋白系统参与完成。而Ⅱ型只需要 Cas9 这一种蛋白参与免疫过程，其结构组成相对简单，是目前研究最深入类型(Makarova et al.，2011)。CRISPER/Csa9 Ⅱ型系统一般经过3 个阶段：（1）间隔区 spacer 的获得；（2）crRNA（CRISPR-derived RNA）的加工；（3）target 的干扰(Wiedenheft et al.，2012)。第一阶段将外源 DNA 片段通过非同源重组整合到 CRISPR 簇中，形成一个新的间隔序列；第二阶段的完成是在前导序列 PAMs 作用下的 CRISPR 基因座位点形成前体 RNA（pre-crRNA），通过 Cas9蛋白和 RNAaseⅢ核酸酶的剪切、加工形成成熟 crRNA(Karginov et al.，2010)；第三阶段当宿主菌再次受到外源 DNA 侵染时，crRNA 和 tracrRNA（trans-activatingchimeric RNA）形成的复合体特异性结合外源 DNA，在 Cas9 蛋白核酸内切酶的作用下剪切双链 DNA 最终达到保护宿主菌的目的(Garneau et al.，2010)。
(3) tRNA-sgRNA 表达系统CRISPR/Cas9 的靶向能力和多重编辑效率往往会受到 sgRNA 表达策略的限制。为此，宾夕法尼亚大学的 Yang 教授的研究团队开发了一个基于 CRISPR 编辑技术的新系统，以期寻找一种简便、高效编辑多基因位点的方法。tRNA 加工系统包含了启动子元件、poⅢ等，其作用相当于转录增强子，能够精确切割 tRNA 前体两端且 tRNA 大量存在于细胞中，基于以上这些特点研究人员将 tRNA 与 gRNA 结合起来，合成一个多顺反子基因 PTG，将多个 sgRNA 与 tRNA 串联在同一表达载体上(Xie et al.，2015)（图 1-3）。研究显示，内源 tRNA 加工系统能够精确加工这个合成基因，有效生成大量携带正确靶向序列的 gRNA，引导 Cas9 编辑多个目标染色体。这一策略能够在稳定的转基因水稻中高效（高达 100%）实现多重基因组编辑和染色体片段的删除(Xie et al.，2015)。此后，tRNA-sgRNA 这套系统还成功应用于敲除与玉米(Qi et al.，2016)、小麦(Wang et al.，2016)生长发育相关的基因，显著提高了 CRISPR/Cas9 的靶向能力和多重编辑效率，极大程度促进作物遗传及品种改良等研究。
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于SRK基因序列分析的甘蓝自交不亲和系单倍型鉴定及验证[J]. 郑敏,朱陈曾,刘梦慈,徐冰冰,马存发,李勤菲,任雪松,司军,宋洪元. 中国蔬菜. 2018(03)
[2]两种密码子优化的Cas9编码基因在斑马鱼胚胎中基因敲除效率的比较[J]. 张峰华,王厚鹏,黄思雨,熊凤,朱作言,孙永华. 遗传. 2016(02)
[3]CRISPR/Cas9的应用及脱靶效应研究进展[J]. 郑武,谷峰. 遗传. 2015(10)
[4]辣椒雄性不育系及保持系小孢子发育的细胞学比较[J]. 王兰兰,王晓林,魏兵强,陈灵芝,张茹. 西北农业学报. 2015(01)
[5]水稻隐性核雄性不育基因研究进展及育种应用探讨[J]. 马西青,方才臣,邓联武,万向元. 中国水稻科学. 2012(05)
[6]甘蓝胞质雄性不育系CMS158小孢子发生的细胞学研究[J]. 许忠民,张恩慧,程永安,巩振辉,马青山. 西北农业学报. 2012(03)
[7]两种甘蓝Ogura细胞质雄性不育源的分子鉴别[J]. 张扬勇,方智远,王庆彪,刘玉梅,杨丽梅,庄木,孙培田. 中国农业科学. 2011(14)
[8]甘蓝细胞质雄性不育材料分子鉴定及花器官形态对核背景的响应[J]. 张艳,王小佳,李成琼,宋洪元,任雪松,司军. 园艺学报. 2010(06)
[9]甘蓝细胞质雄性不育类型的分子鉴定[J]. 陈烨丽,陈学好,陈锦秀,缪体云,薄天岳. 上海农业学报. 2009(03)
[10]芸薹属自交不亲和功能因子及分子机制研究进展[J]. 卢军,李乐玉,陈晓丹,朱利泉,王小佳. 广西农业科学. 2007(06)
博士论文
[1]CRISPR-Cas9介导的玉米基因组定点编辑研究[D]. 朱金洁.中国农业大学 2015
[2]四种类型甘蓝雄性不育系花药败育特征及基因表达谱分析[D]. 康俊根.中国农业科学院 2006
硕士论文
[1]利用CRISPR/Cas9技术编辑甘蓝基因的初步研究[D]. 马存发.西南大学 2017
[2]拟南芥ms1回复突变筛选及基因定位[D]. 李亚东.四川农业大学 2016
本文编号：3308568
【文章来源】：西南大学重庆市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：113 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
茉莉酸（JA）生物合成途径Fig.1-1Biosynthesisofjasmonates
进一步分析 CRISPR/Cas 的结构主要如下三个部分：一个 CRISPR 簇，包括一段非常保守的重复序列（repeat）和长度相似的间隔序列（spacer）；CRISPR 簇前端的引导序列（leader sequence）；CRISPR 簇侧翼的一些辅助基因（CRISPRassociated genes，cas），如图 1-2 所示。目前研究发现 CRISPER/Csa9 系统有 3 种，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，由于Ⅰ型和Ⅲ型的工作机制较为复杂，需要复杂的 Cas 蛋白系统参与完成。而Ⅱ型只需要 Cas9 这一种蛋白参与免疫过程，其结构组成相对简单，是目前研究最深入类型(Makarova et al.，2011)。CRISPER/Csa9 Ⅱ型系统一般经过3 个阶段：（1）间隔区 spacer 的获得；（2）crRNA（CRISPR-derived RNA）的加工；（3）target 的干扰(Wiedenheft et al.，2012)。第一阶段将外源 DNA 片段通过非同源重组整合到 CRISPR 簇中，形成一个新的间隔序列；第二阶段的完成是在前导序列 PAMs 作用下的 CRISPR 基因座位点形成前体 RNA（pre-crRNA），通过 Cas9蛋白和 RNAaseⅢ核酸酶的剪切、加工形成成熟 crRNA(Karginov et al.，2010)；第三阶段当宿主菌再次受到外源 DNA 侵染时，crRNA 和 tracrRNA（trans-activatingchimeric RNA）形成的复合体特异性结合外源 DNA，在 Cas9 蛋白核酸内切酶的作用下剪切双链 DNA 最终达到保护宿主菌的目的(Garneau et al.，2010)。
(3) tRNA-sgRNA 表达系统CRISPR/Cas9 的靶向能力和多重编辑效率往往会受到 sgRNA 表达策略的限制。为此，宾夕法尼亚大学的 Yang 教授的研究团队开发了一个基于 CRISPR 编辑技术的新系统，以期寻找一种简便、高效编辑多基因位点的方法。tRNA 加工系统包含了启动子元件、poⅢ等，其作用相当于转录增强子，能够精确切割 tRNA 前体两端且 tRNA 大量存在于细胞中，基于以上这些特点研究人员将 tRNA 与 gRNA 结合起来，合成一个多顺反子基因 PTG，将多个 sgRNA 与 tRNA 串联在同一表达载体上(Xie et al.，2015)（图 1-3）。研究显示，内源 tRNA 加工系统能够精确加工这个合成基因，有效生成大量携带正确靶向序列的 gRNA，引导 Cas9 编辑多个目标染色体。这一策略能够在稳定的转基因水稻中高效（高达 100%）实现多重基因组编辑和染色体片段的删除(Xie et al.，2015)。此后，tRNA-sgRNA 这套系统还成功应用于敲除与玉米(Qi et al.，2016)、小麦(Wang et al.，2016)生长发育相关的基因，显著提高了 CRISPR/Cas9 的靶向能力和多重编辑效率，极大程度促进作物遗传及品种改良等研究。
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于SRK基因序列分析的甘蓝自交不亲和系单倍型鉴定及验证[J]. 郑敏,朱陈曾,刘梦慈,徐冰冰,马存发,李勤菲,任雪松,司军,宋洪元. 中国蔬菜. 2018(03)
[2]两种密码子优化的Cas9编码基因在斑马鱼胚胎中基因敲除效率的比较[J]. 张峰华,王厚鹏,黄思雨,熊凤,朱作言,孙永华. 遗传. 2016(02)
[3]CRISPR/Cas9的应用及脱靶效应研究进展[J]. 郑武,谷峰. 遗传. 2015(10)
[4]辣椒雄性不育系及保持系小孢子发育的细胞学比较[J]. 王兰兰,王晓林,魏兵强,陈灵芝,张茹. 西北农业学报. 2015(01)
[5]水稻隐性核雄性不育基因研究进展及育种应用探讨[J]. 马西青,方才臣,邓联武,万向元. 中国水稻科学. 2012(05)
[6]甘蓝胞质雄性不育系CMS158小孢子发生的细胞学研究[J]. 许忠民,张恩慧,程永安,巩振辉,马青山. 西北农业学报. 2012(03)
[7]两种甘蓝Ogura细胞质雄性不育源的分子鉴别[J]. 张扬勇,方智远,王庆彪,刘玉梅,杨丽梅,庄木,孙培田. 中国农业科学. 2011(14)
[8]甘蓝细胞质雄性不育材料分子鉴定及花器官形态对核背景的响应[J]. 张艳,王小佳,李成琼,宋洪元,任雪松,司军. 园艺学报. 2010(06)
[9]甘蓝细胞质雄性不育类型的分子鉴定[J]. 陈烨丽,陈学好,陈锦秀,缪体云,薄天岳. 上海农业学报. 2009(03)
[10]芸薹属自交不亲和功能因子及分子机制研究进展[J]. 卢军,李乐玉,陈晓丹,朱利泉,王小佳. 广西农业科学. 2007(06)
博士论文
[1]CRISPR-Cas9介导的玉米基因组定点编辑研究[D]. 朱金洁.中国农业大学 2015
[2]四种类型甘蓝雄性不育系花药败育特征及基因表达谱分析[D]. 康俊根.中国农业科学院 2006
硕士论文
[1]利用CRISPR/Cas9技术编辑甘蓝基因的初步研究[D]. 马存发.西南大学 2017
[2]拟南芥ms1回复突变筛选及基因定位[D]. 李亚东.四川农业大学 2016
本文编号：3308568
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