生菜CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立
发布时间：2021-07-30 10:34
CRISPR/Cas9基因编辑技术已经成功应用于多种植物基因组的编辑,但是在生菜中鲜有报道。本研究拟在生菜（Lactuca sati va L.）中建立CRISPR/Cas9基因编辑体系。首先根据生菜FANCM基因序列设计靶位点,构建Lsfancm-CRISPR/Cas9载体。然后以生菜子叶作为外植体,通过农杆菌侵染、共培养、愈伤组织诱导、芽再生及生根培养等过程,对生菜进行农杆菌介导的遗传转化,共获得24株T0代转基因阳性植株。进一步对靶位点序列进行PCR并测序分析,发现4株转基因生菜的靶位点发生基因编辑,产生fancm杂合突变体,并且在T1代植株中鉴定到纯合突变体。以上结果表明,本研究已成功将CRISPR/Cas9基因编辑体系有效地运用于生菜中,该体系的建立可为将来生菜的基因功能研究及分子育种提供重要的技术参考。
【文章来源】：植物生理学报. 2017,53(04)北大核心CSCD
【文章页数】：11 页
【部分图文】：
pHSN401载体结构示意图
738植物生理学报图2CRIPSR/Cas9系统基因组编辑原理图Fig.2TheschematicdiagramofgenomeeditingusingCRIPSR/Cas9system洗3次,最后转移到1/2MS(MS盐2.37g·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂7.5g·L-1,pH5.8)培养基,培养温度为22~24°C,16h光照,光照强度约100μmol·m-2·s-1。2.2.2外植体准备种子萌发5~6d后,将长度约5~7mm的子叶外植体从幼苗上切下。2.2.3农杆菌侵染将pSoup质粒转化根癌农杆菌GV3101感受态,然后将Lsfancm-CRIPSR/Cas9载体转化GV3101/pSoup感受态,以BsaI-T-F和BsaI-T-R为引物(表1)进行菌落PCR,挑选阳性单克隆菌落,接种在含有50μg·mL-1卡那霉素、50μg·mL-1利福平、25μg·mL-1庆大霉素、5μg·mL-1四环素的LB液体培养基中,摇菌培养(220r·min-1,28°C)约12h至OD600=0.6~0.8。从上述菌液中取200μL稀释于20mL添加相同抗生素的LB液体培养基中,在220r·min-1,28°C条件下摇菌10~12h至OD600=0.6~0.8。将菌液在1600×g,7°C条件下离心5min,用MS0(MS4.74g·L-1+蔗糖30g·L-1,pH5.8)重悬浮菌体,调整OD600=0.6~0.8。最后将外植体在菌液中浸泡10min。2.2.4共培养将在农杆菌中浸泡过的外植体转移至MS1[MS盐4.74g·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂7.5g·L-1+激动素(kinetin,KT)1.0mg·L-1+吲哚乙酸(indoleaceticacid,IAA)0.2mg·L-1,pH5.8]培养基,使其背部接触培养基。将外植体在黑暗条件下25°C共培养2d。2.2.5愈伤组织诱导及芽再生经过2d的共培养,将外植体转移至MS2(MS1培养基+hyg17.0mg·L-1+特美汀300mg·L-1,pH5.8)培养基,使其背部接触到培养基,在100μmol·m-2·s-1的光照强度,25°C条件下培养。每隔20d将外植体转移至新的
禹明森等:生菜CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立739图3Lsfancm-CRIPSR/Cas9载体构建流程图Fig.3TheflowchartofLsfancm-CRIPSR/Cas9vectorconstructionU6-26t:拟南芥U6终止子;U6-29p:拟南芥U6启动子;BsaI-T-F/R:靶位点正/反向引物;BsaI-T:融合BsaI酶切位点的靶序列。时,将它小心切下转移至MS3(1/2MS培养基+IAA0.1mg·L-1,pH5.8)培养基上诱导生根。2.2.7驯化和移栽将幼苗移栽到营养土上(蛭石:营养土:珍珠岩=9:3:1),置于育苗盒内保湿培养,光照培养并且逐步减低湿度至室内正常湿度(培养温度22~24°C,光照时间12h,光照强度约200μmol·m-2·s-1)。等到幼苗驯化2~3周后,放置在光照培养箱中培养生长。在幼苗以及生长时期,设定光照培养箱的条件为光照时间8h,温度20°C;黑暗时间16h,温度15°C。诱导开花时期,设定光照培养箱的条件为光照时间14h,温度30°C;黑暗时间10h,温度25°C。2.3转基因植株鉴定2.3.1转基因植株潮霉素抗性基因PCR鉴定本研究采用TaKaRaMiniBESTPlantGenomicDNAExtractionKit试剂盒提取生菜的基因组DNA,然后以潮霉素抗性基因引物HptII-F和HptII-R为鉴定引物(表1)对转基因植株DNA进行PCR扩增:94°C预变性5min;94°C变性30s,60°C退火30s,72°C延伸50s,35个循环后;72°C再延伸10min。2.3.2转基因阳性植株测序以引物Lsfancm-CRISPRseq-T-F和Lsfancm-CRISPRseq-T-R作为测序鉴定引物(表1)对转基因阳性植株进行PCR扩增(94°C预变性3min;94°C变性15s,55°C退火15s,72°C延伸1min,35个循环后;72°C再延伸10min)并且测序。本研究的引物合成以及测序服务由上海睿迪生物技术有限公司完成。2.3.3生菜基因靶位点序列分析根据测序的峰型图以及碱基序列来确定生菜的基因靶位点是否发生编辑。根据PCR产物测序峰型图
【参考文献】：
期刊论文
[1]共转化Atpsy和folE基因提高生菜类胡萝卜素和叶酸含量[J]. 付雪晴,郭新波,尤丽佳,唐岳立,程海祺,王国丰,唐克轩. 上海交通大学学报(农业科学版). 2012(06)
[2]禽流感抗原基因NA导入生菜的研究[J]. 范亚丽,李进,阮颖,刘春林. 湖南农业科学. 2012(05)
[3]正交设计优化皱叶生菜离体再生体系[J]. 朱春燕,雷建军,周浩,吴敏,陈清,陈燕珍,杨素华,俞守义. 热带医学杂志. 2008(04)
[4]生菜生物技术育种研究进展[J]. 付雅丽,牛瑞生,樊建英,赵璇,王虎,刘铁铮. 江西农业学报. 2007(10)
[5]生菜遗传转化体系的建立及转基因研究[J]. 邓小莉,周岩,常景玲. 云南植物研究. 2007(01)
[6]TDZ对香椿愈伤组织诱导及芽增殖生长等的影响[J]. 张小红,张红燕,武军,闵东红,康冰,李军超. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2002(05)
[7]叶用莴苣离体培养和植株再生[J]. 朱路英,刘玲,孟祥栋,张振贤. 园艺学报. 2002(02)
[8]人小肠三叶因子（hITF）基因在生菜中的整合与表达[J]. 左晓峰,张晓钰,单龙,肖传英,何笃修,茹炳根. 植物学报. 2001(10)
本文编号：3311247
【文章来源】：植物生理学报. 2017,53(04)北大核心CSCD
【文章页数】：11 页
【部分图文】：
pHSN401载体结构示意图
738植物生理学报图2CRIPSR/Cas9系统基因组编辑原理图Fig.2TheschematicdiagramofgenomeeditingusingCRIPSR/Cas9system洗3次,最后转移到1/2MS(MS盐2.37g·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂7.5g·L-1,pH5.8)培养基,培养温度为22~24°C,16h光照,光照强度约100μmol·m-2·s-1。2.2.2外植体准备种子萌发5~6d后,将长度约5~7mm的子叶外植体从幼苗上切下。2.2.3农杆菌侵染将pSoup质粒转化根癌农杆菌GV3101感受态,然后将Lsfancm-CRIPSR/Cas9载体转化GV3101/pSoup感受态,以BsaI-T-F和BsaI-T-R为引物(表1)进行菌落PCR,挑选阳性单克隆菌落,接种在含有50μg·mL-1卡那霉素、50μg·mL-1利福平、25μg·mL-1庆大霉素、5μg·mL-1四环素的LB液体培养基中,摇菌培养(220r·min-1,28°C)约12h至OD600=0.6~0.8。从上述菌液中取200μL稀释于20mL添加相同抗生素的LB液体培养基中,在220r·min-1,28°C条件下摇菌10~12h至OD600=0.6~0.8。将菌液在1600×g,7°C条件下离心5min,用MS0(MS4.74g·L-1+蔗糖30g·L-1,pH5.8)重悬浮菌体,调整OD600=0.6~0.8。最后将外植体在菌液中浸泡10min。2.2.4共培养将在农杆菌中浸泡过的外植体转移至MS1[MS盐4.74g·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂7.5g·L-1+激动素(kinetin,KT)1.0mg·L-1+吲哚乙酸(indoleaceticacid,IAA)0.2mg·L-1,pH5.8]培养基,使其背部接触培养基。将外植体在黑暗条件下25°C共培养2d。2.2.5愈伤组织诱导及芽再生经过2d的共培养,将外植体转移至MS2(MS1培养基+hyg17.0mg·L-1+特美汀300mg·L-1,pH5.8)培养基,使其背部接触到培养基,在100μmol·m-2·s-1的光照强度,25°C条件下培养。每隔20d将外植体转移至新的
禹明森等:生菜CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立739图3Lsfancm-CRIPSR/Cas9载体构建流程图Fig.3TheflowchartofLsfancm-CRIPSR/Cas9vectorconstructionU6-26t:拟南芥U6终止子;U6-29p:拟南芥U6启动子;BsaI-T-F/R:靶位点正/反向引物;BsaI-T:融合BsaI酶切位点的靶序列。时,将它小心切下转移至MS3(1/2MS培养基+IAA0.1mg·L-1,pH5.8)培养基上诱导生根。2.2.7驯化和移栽将幼苗移栽到营养土上(蛭石:营养土:珍珠岩=9:3:1),置于育苗盒内保湿培养,光照培养并且逐步减低湿度至室内正常湿度(培养温度22~24°C,光照时间12h,光照强度约200μmol·m-2·s-1)。等到幼苗驯化2~3周后,放置在光照培养箱中培养生长。在幼苗以及生长时期,设定光照培养箱的条件为光照时间8h,温度20°C;黑暗时间16h,温度15°C。诱导开花时期,设定光照培养箱的条件为光照时间14h,温度30°C;黑暗时间10h,温度25°C。2.3转基因植株鉴定2.3.1转基因植株潮霉素抗性基因PCR鉴定本研究采用TaKaRaMiniBESTPlantGenomicDNAExtractionKit试剂盒提取生菜的基因组DNA,然后以潮霉素抗性基因引物HptII-F和HptII-R为鉴定引物(表1)对转基因植株DNA进行PCR扩增:94°C预变性5min;94°C变性30s,60°C退火30s,72°C延伸50s,35个循环后;72°C再延伸10min。2.3.2转基因阳性植株测序以引物Lsfancm-CRISPRseq-T-F和Lsfancm-CRISPRseq-T-R作为测序鉴定引物(表1)对转基因阳性植株进行PCR扩增(94°C预变性3min;94°C变性15s,55°C退火15s,72°C延伸1min,35个循环后;72°C再延伸10min)并且测序。本研究的引物合成以及测序服务由上海睿迪生物技术有限公司完成。2.3.3生菜基因靶位点序列分析根据测序的峰型图以及碱基序列来确定生菜的基因靶位点是否发生编辑。根据PCR产物测序峰型图
【参考文献】：
期刊论文
[1]共转化Atpsy和folE基因提高生菜类胡萝卜素和叶酸含量[J]. 付雪晴,郭新波,尤丽佳,唐岳立,程海祺,王国丰,唐克轩. 上海交通大学学报(农业科学版). 2012(06)
[2]禽流感抗原基因NA导入生菜的研究[J]. 范亚丽,李进,阮颖,刘春林. 湖南农业科学. 2012(05)
[3]正交设计优化皱叶生菜离体再生体系[J]. 朱春燕,雷建军,周浩,吴敏,陈清,陈燕珍,杨素华,俞守义. 热带医学杂志. 2008(04)
[4]生菜生物技术育种研究进展[J]. 付雅丽,牛瑞生,樊建英,赵璇,王虎,刘铁铮. 江西农业学报. 2007(10)
[5]生菜遗传转化体系的建立及转基因研究[J]. 邓小莉,周岩,常景玲. 云南植物研究. 2007(01)
[6]TDZ对香椿愈伤组织诱导及芽增殖生长等的影响[J]. 张小红,张红燕,武军,闵东红,康冰,李军超. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2002(05)
[7]叶用莴苣离体培养和植株再生[J]. 朱路英,刘玲,孟祥栋,张振贤. 园艺学报. 2002(02)
[8]人小肠三叶因子（hITF）基因在生菜中的整合与表达[J]. 左晓峰,张晓钰,单龙,肖传英,何笃修,茹炳根. 植物学报. 2001(10)
本文编号：3311247
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