采用CELⅠ酶粗提物高效鉴定CRISPR/Cas9介导的基因突变
发布时间：2021-08-08 07:19
CRISPR/Cas9是新兴的基因组编辑技术,该技术操作简单、效率高,已成为目前最主流的基因组编辑技术。利用该技术进行突变体创制,对基因功能研究和育种应用具有重要的意义,而快速、高效、低成本的基因编辑个体鉴定是其中的重要环节。本研究对影响CELⅠ粗提物鉴定CRISPR/Cas9介导的水稻基因编辑个体的条件,包括蛋白用量及作用时间、PCR反应缓冲液等条件进行了探索,并将整个检测体系集成于一管操作。同时,采用CELⅠ粗提物检测了CRISPR/Cas9介导水稻stn1突变的T0代植株及后代,对杂合突变、纯合突变及双等位突变的鉴定策略进行了探讨;该方法检测正确率经测序验证达100%。上述结果表明,采用CELⅠ粗提物检测突变体与已有方法比较具有廉价、快速和高效的特点。
【文章来源】：生物工程学报. 2017,33(05)北大核心CSCD
【文章页数】：10 页
【部分图文】：
CRISPR载体图谱和stn1的CRISPR靶位点设计
?或加等量的野生型DNA扩增产物)迚行变、性理，再向其中加CELⅠ酶，42℃温育，用EDTA终止反应。取10μL样品迚行电泳检测。2结果与讨论2.1CELⅠ酶粗提物用于突变体的检测dep1是水稻立密穗制基因[23]，本论文dep1-29突变株由本实验室制，测序结果明，该植株为双点突变(–2/–5)(图2)。为检测CELⅠ酶粗物是否切割异源双链DNA，取1μLCELⅠ酶粗物加到经变性、性理的PCR样品中，与不加CELⅠ酶的样品迚行对比。电泳结果显示CELⅠ酶可以切割异源双链DNA，切出带符合预期，证明CELⅠ酶粗物适用于点突变的检测。图2dep1-29突变株突变位点的测序结果和CELⅠ酶切检测结果(dep1-29a和dep1-29b表示dep1-29突变株包含双等位突变的两种突变类型)Fig.2Sequenceofdep1-29mutantandCELⅠanalysis.dep1-29aanddep1-29bshowedthetargetsequencesofbi-allelesmutationofdep1-29.
挠昧浚?盖行Ч?换嵊邢灾???酶切时间是影响酶切效果的另一重要因素。采用0.1μgCELⅠ酶对dep1-29突变体材料的PCR产物迚行酶切(图3)。结果明，CELⅠ酶作用10min时可以见到酶切的带，随着时间增加，CELⅠ酶的切割效逐渐升，在40min时达到最佳。继续增加时间不升CELⅠ酶的切割效。2.3PCR体系对CELⅠ切割效率的影响简、快捷的突变体鉴定法要求采用CELⅠ粗物在合适的PCR缓冲体系中迚行酶切。因此，首先选目前普遍使用的聚合酶和缓冲系统(rTaq聚合酶、LATaq聚合酶、BlendTaq聚合酶、KOD聚合酶)迚行实验(图4)。结图3CELⅠ酶粗提物用量及酶切时间对突变鉴定的影响Fig.3EffectsoftheamountofCELⅠcrudeextractsanddigestiontimeonmutationidentification.图4不同PCR体系对CELⅠ粗提物酶切效率的影响Fig.4EffectofdigestionusingCELⅠcrudeextractsindifferentPCRsystems.果明，KOD酶的扩增效果最佳，CELⅠ酶在该体系中的切割效果不理想。BTaq酶体系和rTaq酶体系中PCR扩增效果差，电泳检测时不看见1000bp的带。LATaq酶体系够扩增到dep1片段，且CELⅠ酶在该体系中现出了切割活性。迚一步通过采用LAbuffer与不同的Taq酶组合，収现BTaq与LAbuffer组合可以高PCR的效和保证CELⅠ的酶切活性。2.4CELⅠ酶对CRISPR介导的stn1基因敲除株突变进行分型采用农杆菌导的法，我们将stn1-CRISPR转化水稻，获得35个独立的转基因株系。由于转
【参考文献】：
期刊论文
[1]限制性内切酶策略鉴定CRISPR/Cas9介导的Chrm3基因敲除小鼠[J]. 高旭,马宁,王大勇,张赫,张艳芬,徐亚,贺军,徐书会,霍亚丽,杜智敏. 中国生物化学与分子生物学报. 2016(04)
[2]植物基因组编辑及衍生技术最新研究进展[J]. 单奇伟,高彩霞. 遗传. 2015(10)
[3]基因修饰技术研究进展[J]. 张白雪,孙其信,李海峰. 生物工程学报. 2015(08)
[4]CRISPR/Cas系统在植物基因组编辑中的应用[J]. 瞿礼嘉,郭冬姝,张金喆,秦跟基. 生命科学. 2015(01)
[5]Targeted Mutagenesis in Zea mays Using TALENs and the CRISPR/Cas System[J]. Zhen Liang,Kang Zhang,Kunling Chen,Caixia Gao. Journal of Genetics and Genomics. 2014(02)
[6]CELI粗提物用于点突变检测的技术[J]. 崔海瑞,李春楠,吴殿星,舒庆尧. 核农学报. 2011(01)
[7]CELⅠ酶的粗提取及其活性检测[J]. 韩锁义,杨玛丽,盖钧镒,喻德跃. 遗传. 2006(09)
本文编号：3329497
【文章来源】：生物工程学报. 2017,33(05)北大核心CSCD
【文章页数】：10 页
【部分图文】：
CRISPR载体图谱和stn1的CRISPR靶位点设计
?或加等量的野生型DNA扩增产物)迚行变、性理，再向其中加CELⅠ酶，42℃温育，用EDTA终止反应。取10μL样品迚行电泳检测。2结果与讨论2.1CELⅠ酶粗提物用于突变体的检测dep1是水稻立密穗制基因[23]，本论文dep1-29突变株由本实验室制，测序结果明，该植株为双点突变(–2/–5)(图2)。为检测CELⅠ酶粗物是否切割异源双链DNA，取1μLCELⅠ酶粗物加到经变性、性理的PCR样品中，与不加CELⅠ酶的样品迚行对比。电泳结果显示CELⅠ酶可以切割异源双链DNA，切出带符合预期，证明CELⅠ酶粗物适用于点突变的检测。图2dep1-29突变株突变位点的测序结果和CELⅠ酶切检测结果(dep1-29a和dep1-29b表示dep1-29突变株包含双等位突变的两种突变类型)Fig.2Sequenceofdep1-29mutantandCELⅠanalysis.dep1-29aanddep1-29bshowedthetargetsequencesofbi-allelesmutationofdep1-29.
挠昧浚?盖行Ч?换嵊邢灾???酶切时间是影响酶切效果的另一重要因素。采用0.1μgCELⅠ酶对dep1-29突变体材料的PCR产物迚行酶切(图3)。结果明，CELⅠ酶作用10min时可以见到酶切的带，随着时间增加，CELⅠ酶的切割效逐渐升，在40min时达到最佳。继续增加时间不升CELⅠ酶的切割效。2.3PCR体系对CELⅠ切割效率的影响简、快捷的突变体鉴定法要求采用CELⅠ粗物在合适的PCR缓冲体系中迚行酶切。因此，首先选目前普遍使用的聚合酶和缓冲系统(rTaq聚合酶、LATaq聚合酶、BlendTaq聚合酶、KOD聚合酶)迚行实验(图4)。结图3CELⅠ酶粗提物用量及酶切时间对突变鉴定的影响Fig.3EffectsoftheamountofCELⅠcrudeextractsanddigestiontimeonmutationidentification.图4不同PCR体系对CELⅠ粗提物酶切效率的影响Fig.4EffectofdigestionusingCELⅠcrudeextractsindifferentPCRsystems.果明，KOD酶的扩增效果最佳，CELⅠ酶在该体系中的切割效果不理想。BTaq酶体系和rTaq酶体系中PCR扩增效果差，电泳检测时不看见1000bp的带。LATaq酶体系够扩增到dep1片段，且CELⅠ酶在该体系中现出了切割活性。迚一步通过采用LAbuffer与不同的Taq酶组合，収现BTaq与LAbuffer组合可以高PCR的效和保证CELⅠ的酶切活性。2.4CELⅠ酶对CRISPR介导的stn1基因敲除株突变进行分型采用农杆菌导的法，我们将stn1-CRISPR转化水稻，获得35个独立的转基因株系。由于转
【参考文献】：
期刊论文
[1]限制性内切酶策略鉴定CRISPR/Cas9介导的Chrm3基因敲除小鼠[J]. 高旭,马宁,王大勇,张赫,张艳芬,徐亚,贺军,徐书会,霍亚丽,杜智敏. 中国生物化学与分子生物学报. 2016(04)
[2]植物基因组编辑及衍生技术最新研究进展[J]. 单奇伟,高彩霞. 遗传. 2015(10)
[3]基因修饰技术研究进展[J]. 张白雪,孙其信,李海峰. 生物工程学报. 2015(08)
[4]CRISPR/Cas系统在植物基因组编辑中的应用[J]. 瞿礼嘉,郭冬姝,张金喆,秦跟基. 生命科学. 2015(01)
[5]Targeted Mutagenesis in Zea mays Using TALENs and the CRISPR/Cas System[J]. Zhen Liang,Kang Zhang,Kunling Chen,Caixia Gao. Journal of Genetics and Genomics. 2014(02)
[6]CELI粗提物用于点突变检测的技术[J]. 崔海瑞,李春楠,吴殿星,舒庆尧. 核农学报. 2011(01)
[7]CELⅠ酶的粗提取及其活性检测[J]. 韩锁义,杨玛丽,盖钧镒,喻德跃. 遗传. 2006(09)
本文编号：3329497
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