薄皮甜瓜CmMAPK3和CmMAPK7在抗白粉病中的作用
发布时间：2021-08-10 07:14
甜瓜（Cucumis melo L.）是我国重要的经济作物之一,其生长发育经常受到各种病害的影响,导致产量和品质下降。白粉病是甜瓜生产中的重要病害,危害植株全株,伴随着生长发育的整个过程。当植物受到病原菌侵染时,植物体内会发生一系列生理生化变化,形成复杂的信号转导途径,将外界信号传递到细胞内,从而引起抗逆基因表达,抵御逆境胁迫。促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activted protein kinase,MAPK）级联途径在植物信号转导过程中发挥着重要作用。本课题组前期研究发现CmMAPK3和CmMAPK7受红光(160μmol m-2s-1·6 h)诱导上调表达,甜瓜幼苗接种白粉病菌后其表达量高于对照,但红光诱导后再接菌,两个基因的转录水平低于单独接菌处理。因此,我们构建了病毒诱导基因沉默载体,对两个基因的抗白粉病功能做了初步研究,主要结果如下:1.采用In-Fusion方法,构建CmMAPK3和CmMAPK7沉默载体。在甜瓜幼苗子叶完全展开时,利用子叶注射法将菌液（TRV:00,TRV:CmMAPK3,TRV:CmMAPK7）真空...
【文章来源】：沈阳农业大学辽宁省
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
MAPK级联信号途径传递外界信号示意图（Danquahetal.,2014）
沈阳农业大学硕士学位论文152min，在超净工作台中加入890μLLB液体培养基，37℃150r震荡培养1h后，取150μL菌液涂布到LB固体培养基（100mg/mLAmp）上，37℃倒置培养14h。待平板长出单菌落后，用枪头挑取单菌落到1mLLB液体培养基（100mg/mLAmp）中，37℃震荡培养14h。此菌液用于PCR鉴定：成分Constituents体积VolumeExTaq酶（PremixTaq）12.5μLF1μLR1μL菌液1μLddH2Oupto25μL反应程序为98℃30s；98℃10s；60℃15s；72℃1min40s；72℃10min，循环数35。后进行凝胶电泳筛选阳性克隆，对其进行编号后送测序，并于-80℃保存菌液。2.2.3CmMAPK3和CmMAPK7基因沉默表达载体的构建使用In-Fusion方法构建CmMAPK3和CmMAPK7基因沉默表达载体。首先根据基因登录号从甜瓜基因组网站下载甜瓜MAPK所有基因序列，利用DNAMAN进行序列同源比对，找到CmMAPK3和CmMAPK7约300bp的特异序列。根据选择的沉默片段设计In-Fusion引物（表2），限制性酶切位点为BamHI，载体为pTRV2（图2）。图2pTRV2载体图谱Fig.2ConstructdiagramofpTRV2vector以克隆得到的CmMAPK3，CmMAPK7质粒为模板，PCR扩增序列约300bp保守序列：98℃30s；98℃10s；60℃15s；72℃20s；72℃10min，循环数35。反应体系为
磁嘌?2h；测菌液OD600=1.6时，于4℃5000r下离心10min，收集菌体。此时，配置侵染缓冲液，将500mMMES10mL，50mMAS1.5mL和1MMgCl2·6H2O5mL加入500mL无菌水中，混匀即为侵染缓冲液。使用侵染缓冲液悬浮菌体，使悬浮液OD600=1.0，将pTRV1分别与TRV:CmMAPK3，TRV:CmMAPK7，pTRV2混合（v:v=1:1），于室温下黑暗静置3h。将制备好的侵染液命名为TRV:00，TRV:CmMAPK3和TRV:CmMAPK7。子叶注射法侵染薄皮甜瓜幼苗：使用一次性注射器将TRV:00，TRV:CmMAPK3和TRV:CmMAPK7侵染液分别注射到薄皮甜瓜子叶背面，使其完全浸透两片子叶（图3）。黑暗放置24h后于光照培养箱中继续培养。图3子叶注射法侵染薄皮甜瓜幼苗子叶Fig.3Cotyledoninjectioninfectedcotyledonofmuskmelonseeding2.2.5病情指数统计白粉病菌侵染严重程度分为4级，1级：白粉病菌覆盖叶面积<25%；2级：25%<白粉病菌覆盖叶面积<50%；3级：50%<白粉病菌覆盖叶面积<75%；4级：白粉病菌覆盖
【参考文献】：
期刊论文
[1]低磷胁迫下光质对番茄幼苗生长及生理抗性的影响[J]. 梁颖,石玉,靳琇,张思瑜,侯雷平,张毅. 中国农学通报. 2020(01)
[2]不同光质对西瓜幼苗光合特性、生理品质及保护酶系统的影响[J]. 张清华,陈昆,赵跃锋. 山西农业科学. 2018(10)
[3]薄皮甜瓜9-脂氧合酶（9-LOX）类型的CmLOX09对逆境、激素和信号类物质的响应（英文）[J]. Li-jun JU,Chong ZHANG,Jing-jing LIAO,Yue-peng LI,Hong-yan QI. Journal of Zhejiang University-Science B（Biomedicine & Biotechnology）. 2018(08)
[4]两个甜瓜材料对白粉病的抗性差异及其生理生化机制研究[J]. 杨瑞平,刘长命,莫言玲,李好,马建祥,张勇,张显. 园艺学报. 2016(04)
[5]碱蓬SgBADH的克隆与分析及植物表达载体构建[J]. 金杭霞,董德坤,杨清华,袁凤杰,郁晓敏,傅旭军,朱丹华. 核农学报. 2016(02)
[6]外源亚精胺对甜瓜幼苗白粉病抗性的影响[J]. 李小玲,刘长命,刘炼红,杨瑞平,郑俊鶱,莫言玲,吴梅梅,张显. 西北植物学报. 2015(09)
[7]干旱胁迫对水稻生长、生理特性和产量的影响[J]. 段素梅,杨安中,黄义德,吴文革,许有尊,陈刚. 核农学报. 2014(06)
[8]甘蓝型油菜MAPK7基因家族及其启动子的克隆与表达分析[J]. 朱斌,陆俊杏,彭茜,翁昌梅,王淑文,余浩,李加纳,卢坤,梁颖. 作物学报. 2013(05)
[9]辣椒定位于叶绿体的13-脂氧合酶基因（CaLOX2）克隆及表达分析[J]. 贾庆利,巩振辉,李大伟. 农业生物技术学报. 2012(10)
[10]甜瓜抗白粉病的生理机制[J]. 张慧君,张建农. 江苏农业学报. 2009(05)
博士论文
[1]GhMKK9介导的MAPK级联信号途径调控棉花抗枯萎病的分子机理研究[D]. 贾海红.山东农业大学 2018
[2]植物MAPK级联途径基因家族的进化分析及番茄SlMPK13的功能鉴定[D]. 王洁.浙江大学 2015
[3]光质对黄瓜幼苗光合效率和白粉病抗性的调控机理[D]. 王虹.浙江大学 2009
硕士论文
[1]甜瓜MAPK级联途径基因家族的鉴定及CmMPKs功能分析[D]. 李悦鹏.沈阳农业大学 2019
[2]野生草莓WRKY和MAPK基因家族鉴定、表达及FvWRKY42基因功能研究[D]. 未魏.西北农林科技大学 2017
[3]椭圆灰葡萄孢（Botrytis cinerea）胁迫下亚洲百合的生理响应及调节基因MAPK的克隆[D]. 宋翔宇.沈阳农业大学 2016
[4]BTH诱导甜瓜（Cucumis melo L.）抗白粉病机理及信号转导途径的研究[D]. 王春林.甘肃农业大学 2007
本文编号：3333726
【文章来源】：沈阳农业大学辽宁省
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
MAPK级联信号途径传递外界信号示意图（Danquahetal.,2014）
沈阳农业大学硕士学位论文152min，在超净工作台中加入890μLLB液体培养基，37℃150r震荡培养1h后，取150μL菌液涂布到LB固体培养基（100mg/mLAmp）上，37℃倒置培养14h。待平板长出单菌落后，用枪头挑取单菌落到1mLLB液体培养基（100mg/mLAmp）中，37℃震荡培养14h。此菌液用于PCR鉴定：成分Constituents体积VolumeExTaq酶（PremixTaq）12.5μLF1μLR1μL菌液1μLddH2Oupto25μL反应程序为98℃30s；98℃10s；60℃15s；72℃1min40s；72℃10min，循环数35。后进行凝胶电泳筛选阳性克隆，对其进行编号后送测序，并于-80℃保存菌液。2.2.3CmMAPK3和CmMAPK7基因沉默表达载体的构建使用In-Fusion方法构建CmMAPK3和CmMAPK7基因沉默表达载体。首先根据基因登录号从甜瓜基因组网站下载甜瓜MAPK所有基因序列，利用DNAMAN进行序列同源比对，找到CmMAPK3和CmMAPK7约300bp的特异序列。根据选择的沉默片段设计In-Fusion引物（表2），限制性酶切位点为BamHI，载体为pTRV2（图2）。图2pTRV2载体图谱Fig.2ConstructdiagramofpTRV2vector以克隆得到的CmMAPK3，CmMAPK7质粒为模板，PCR扩增序列约300bp保守序列：98℃30s；98℃10s；60℃15s；72℃20s；72℃10min，循环数35。反应体系为
磁嘌?2h；测菌液OD600=1.6时，于4℃5000r下离心10min，收集菌体。此时，配置侵染缓冲液，将500mMMES10mL，50mMAS1.5mL和1MMgCl2·6H2O5mL加入500mL无菌水中，混匀即为侵染缓冲液。使用侵染缓冲液悬浮菌体，使悬浮液OD600=1.0，将pTRV1分别与TRV:CmMAPK3，TRV:CmMAPK7，pTRV2混合（v:v=1:1），于室温下黑暗静置3h。将制备好的侵染液命名为TRV:00，TRV:CmMAPK3和TRV:CmMAPK7。子叶注射法侵染薄皮甜瓜幼苗：使用一次性注射器将TRV:00，TRV:CmMAPK3和TRV:CmMAPK7侵染液分别注射到薄皮甜瓜子叶背面，使其完全浸透两片子叶（图3）。黑暗放置24h后于光照培养箱中继续培养。图3子叶注射法侵染薄皮甜瓜幼苗子叶Fig.3Cotyledoninjectioninfectedcotyledonofmuskmelonseeding2.2.5病情指数统计白粉病菌侵染严重程度分为4级，1级：白粉病菌覆盖叶面积<25%；2级：25%<白粉病菌覆盖叶面积<50%；3级：50%<白粉病菌覆盖叶面积<75%；4级：白粉病菌覆盖
【参考文献】：
期刊论文
[1]低磷胁迫下光质对番茄幼苗生长及生理抗性的影响[J]. 梁颖,石玉,靳琇,张思瑜,侯雷平,张毅. 中国农学通报. 2020(01)
[2]不同光质对西瓜幼苗光合特性、生理品质及保护酶系统的影响[J]. 张清华,陈昆,赵跃锋. 山西农业科学. 2018(10)
[3]薄皮甜瓜9-脂氧合酶（9-LOX）类型的CmLOX09对逆境、激素和信号类物质的响应（英文）[J]. Li-jun JU,Chong ZHANG,Jing-jing LIAO,Yue-peng LI,Hong-yan QI. Journal of Zhejiang University-Science B（Biomedicine & Biotechnology）. 2018(08)
[4]两个甜瓜材料对白粉病的抗性差异及其生理生化机制研究[J]. 杨瑞平,刘长命,莫言玲,李好,马建祥,张勇,张显. 园艺学报. 2016(04)
[5]碱蓬SgBADH的克隆与分析及植物表达载体构建[J]. 金杭霞,董德坤,杨清华,袁凤杰,郁晓敏,傅旭军,朱丹华. 核农学报. 2016(02)
[6]外源亚精胺对甜瓜幼苗白粉病抗性的影响[J]. 李小玲,刘长命,刘炼红,杨瑞平,郑俊鶱,莫言玲,吴梅梅,张显. 西北植物学报. 2015(09)
[7]干旱胁迫对水稻生长、生理特性和产量的影响[J]. 段素梅,杨安中,黄义德,吴文革,许有尊,陈刚. 核农学报. 2014(06)
[8]甘蓝型油菜MAPK7基因家族及其启动子的克隆与表达分析[J]. 朱斌,陆俊杏,彭茜,翁昌梅,王淑文,余浩,李加纳,卢坤,梁颖. 作物学报. 2013(05)
[9]辣椒定位于叶绿体的13-脂氧合酶基因（CaLOX2）克隆及表达分析[J]. 贾庆利,巩振辉,李大伟. 农业生物技术学报. 2012(10)
[10]甜瓜抗白粉病的生理机制[J]. 张慧君,张建农. 江苏农业学报. 2009(05)
博士论文
[1]GhMKK9介导的MAPK级联信号途径调控棉花抗枯萎病的分子机理研究[D]. 贾海红.山东农业大学 2018
[2]植物MAPK级联途径基因家族的进化分析及番茄SlMPK13的功能鉴定[D]. 王洁.浙江大学 2015
[3]光质对黄瓜幼苗光合效率和白粉病抗性的调控机理[D]. 王虹.浙江大学 2009
硕士论文
[1]甜瓜MAPK级联途径基因家族的鉴定及CmMPKs功能分析[D]. 李悦鹏.沈阳农业大学 2019
[2]野生草莓WRKY和MAPK基因家族鉴定、表达及FvWRKY42基因功能研究[D]. 未魏.西北农林科技大学 2017
[3]椭圆灰葡萄孢（Botrytis cinerea）胁迫下亚洲百合的生理响应及调节基因MAPK的克隆[D]. 宋翔宇.沈阳农业大学 2016
[4]BTH诱导甜瓜（Cucumis melo L.）抗白粉病机理及信号转导途径的研究[D]. 王春林.甘肃农业大学 2007
本文编号：3333726
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