基于CRISPR/Cas9技术的烟草NtDXR基因敲除及功能分析
发布时间：2021-08-17 19:04
为研究烟草5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶（1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase,DXR）基因的表达模式和功能,从普通烟草（Nicotiana tabacum）品种红花大金元中克隆了NtDXR基因,并通过荧光定量PCR技术分析了NtDXR在红花大金元不同发育时期、不同组织中的表达模式。同时利用CRISPR/Cas9技术构建了NtDXR敲除载体,获得了DXR基因突变的植株。结果表明:NtDXR基因在花中的表达量最高,在雌蕊和叶中次之;利用CRISPR/Cas9系统定点敲除NtDXR基因后,检测目的基因靶位点序列发现有碱基的插入、缺失与置换,并且部分T0代转基因阳性植株呈现白化表型,暗示NtDXR基因在烟草叶绿素等色素合成过程中起重要作用,推测NtDXR基因的突变能阻断烟草质体色素的合成。
【文章来源】：中国烟草学会2016年度优秀论文汇编——烟草农业主题中国烟草学会专题资料汇编
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
刀理DXR序列比对结果
2016烟草科技年长度为1500bp左右的片段（图1）。将测序结果与红大基因组数据库中的序列进行比对，结果（图2）表明，该序列与基因组数据库中DXR基因的mRNA序列相似度为99%，所得目的片段为NtDXR基因序列。2.2NtDXR基因表达模式分析提取普通烟草红大不同时期、不同组织的总RNA，反转录成cDNA后，用NtGAPDH基因检测cDNA质量。电泳结果（图3）表明，cDNA质量满足后续实验要求。荧光定量PCR结果（图4）表明，NtDXR在不同组织中的表达量各有不同，在花、叶、雌蕊中的表达量较高，茎尖次之，根、茎、雄蕊中表达量较低。M.Trans2KDNAMarker1.NtDXR基因片段图1NtDXRPCR扩增电泳图Fig.1ElectrophoretogramofNtDXRPCRamplificationNtDXR.本实验中克隆的序列DXR.烟草基因组数据库中的序列图2NtDXR序列比对结果Fig.2SequencealignmentofNtDXRM.Trans2KDNAMarker1~10.依次为大十字期根、大十字期茎、大十字期叶、大十字期茎尖、成熟期根、成熟期茎、成熟期叶、花、雌蕊、雄蕊图3cDNA质量检测图Fig.3ElectrophoretogramofcDNA图4NtDXR基因在烟草不同发育时期、不同组织中的表达Fig.4SpatialandtemporalexpressionpatternsofNtDXR·4·
第49卷第6期2.3NtDXR基因敲除载体构建菌落PCR扩增出500bp左右大小的片段（图5a），表明菌落可能为阳性克拢将菌液送至北京华大基因科技股份有限公司测序，结果（图5b）显示插入目的片段中含有靶位点20bp的核苷酸序列，表明靶位点已成功插入到pORE-Cas9/gRNA载体中，即敲除载体构建成功（图5c）。2.4NtDXR转基因烟株的检测通过构建CRISPR/Cas9敲除载体及运用农杆菌介导的植物转化技术，获得了具有抗卡那霉素的T0代阳性转化苗。提取阳性烟苗叶片基因组DNA进行PCR扩增，以检测外源插入DNA片段。电泳结果（图6）表明，扩增的目的片段大小为390bp，与引物设计扩增序列的大小一致，初步表明在抗性培养基上生长的烟苗基因组内均插入敲除载体序列，即NtDXR敲除载体已成功转入到烟草植株中。2.5T0代转基因烟草表型观察及验证阳性转基因组培幼苗大部分植株呈绿色（图7a），与正常烟草组培苗表型无差异。在T0代阳性转化苗中，发现4株与其他阳性转化苗表型完全不同的植株，表现为白化表型（图7b）。以阳性转基因烟苗基因组DNA为模板，用DXR-jiance-F和DXR-jiance-R引物扩增含有NtDXR基因的靶位点片段，共检测4株白化苗和15株绿色苗中NtDXR基因序列的突变形式，并对不同突变形式出现的概率进行统计。结果（表1、图8）表明，在4株白化苗中，所测得的NtDXR基因靶位点序列均出现不同形式的突变，包括碱基的插入、缺失，但并没有检测到与野生型烟草NtDXR相一致的序列。4株白化苗NtDXR基因靶位点序列有3种突变形式，第一种是在靶位点附近增加1个碱基T或A；第二种是在靶位点附近丢失7个碱基；第三种是在靶位点附近丢失1个碱基T。这3种突变形式均能导致NtDXR蛋白翻译错误，从而使蛋白丧失功能。在15株转基因绿色苗中，只有3株烟?
【参考文献】：
期刊论文
[1]烟草5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶基因（dxr）的克隆和表达分析[J]. 朱晓宇,王景,赵二卫,姚姗姗,崔红. 农业生物技术学报. 2011(02)
[2]植物次生代谢与烟草香味物质[J]. 杨铁钊,李钦奎,李伟. 中国烟草科学. 2005(04)
[3]类萜代谢工程研究进展及在烟草品种改良中的应用前景[J]. 崔红,宋志红. 中国烟草学报. 2003(02)
本文编号：3348323
【文章来源】：中国烟草学会2016年度优秀论文汇编——烟草农业主题中国烟草学会专题资料汇编
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
刀理DXR序列比对结果
2016烟草科技年长度为1500bp左右的片段（图1）。将测序结果与红大基因组数据库中的序列进行比对，结果（图2）表明，该序列与基因组数据库中DXR基因的mRNA序列相似度为99%，所得目的片段为NtDXR基因序列。2.2NtDXR基因表达模式分析提取普通烟草红大不同时期、不同组织的总RNA，反转录成cDNA后，用NtGAPDH基因检测cDNA质量。电泳结果（图3）表明，cDNA质量满足后续实验要求。荧光定量PCR结果（图4）表明，NtDXR在不同组织中的表达量各有不同，在花、叶、雌蕊中的表达量较高，茎尖次之，根、茎、雄蕊中表达量较低。M.Trans2KDNAMarker1.NtDXR基因片段图1NtDXRPCR扩增电泳图Fig.1ElectrophoretogramofNtDXRPCRamplificationNtDXR.本实验中克隆的序列DXR.烟草基因组数据库中的序列图2NtDXR序列比对结果Fig.2SequencealignmentofNtDXRM.Trans2KDNAMarker1~10.依次为大十字期根、大十字期茎、大十字期叶、大十字期茎尖、成熟期根、成熟期茎、成熟期叶、花、雌蕊、雄蕊图3cDNA质量检测图Fig.3ElectrophoretogramofcDNA图4NtDXR基因在烟草不同发育时期、不同组织中的表达Fig.4SpatialandtemporalexpressionpatternsofNtDXR·4·
第49卷第6期2.3NtDXR基因敲除载体构建菌落PCR扩增出500bp左右大小的片段（图5a），表明菌落可能为阳性克拢将菌液送至北京华大基因科技股份有限公司测序，结果（图5b）显示插入目的片段中含有靶位点20bp的核苷酸序列，表明靶位点已成功插入到pORE-Cas9/gRNA载体中，即敲除载体构建成功（图5c）。2.4NtDXR转基因烟株的检测通过构建CRISPR/Cas9敲除载体及运用农杆菌介导的植物转化技术，获得了具有抗卡那霉素的T0代阳性转化苗。提取阳性烟苗叶片基因组DNA进行PCR扩增，以检测外源插入DNA片段。电泳结果（图6）表明，扩增的目的片段大小为390bp，与引物设计扩增序列的大小一致，初步表明在抗性培养基上生长的烟苗基因组内均插入敲除载体序列，即NtDXR敲除载体已成功转入到烟草植株中。2.5T0代转基因烟草表型观察及验证阳性转基因组培幼苗大部分植株呈绿色（图7a），与正常烟草组培苗表型无差异。在T0代阳性转化苗中，发现4株与其他阳性转化苗表型完全不同的植株，表现为白化表型（图7b）。以阳性转基因烟苗基因组DNA为模板，用DXR-jiance-F和DXR-jiance-R引物扩增含有NtDXR基因的靶位点片段，共检测4株白化苗和15株绿色苗中NtDXR基因序列的突变形式，并对不同突变形式出现的概率进行统计。结果（表1、图8）表明，在4株白化苗中，所测得的NtDXR基因靶位点序列均出现不同形式的突变，包括碱基的插入、缺失，但并没有检测到与野生型烟草NtDXR相一致的序列。4株白化苗NtDXR基因靶位点序列有3种突变形式，第一种是在靶位点附近增加1个碱基T或A；第二种是在靶位点附近丢失7个碱基；第三种是在靶位点附近丢失1个碱基T。这3种突变形式均能导致NtDXR蛋白翻译错误，从而使蛋白丧失功能。在15株转基因绿色苗中，只有3株烟?
【参考文献】：
期刊论文
[1]烟草5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶基因（dxr）的克隆和表达分析[J]. 朱晓宇,王景,赵二卫,姚姗姗,崔红. 农业生物技术学报. 2011(02)
[2]植物次生代谢与烟草香味物质[J]. 杨铁钊,李钦奎,李伟. 中国烟草科学. 2005(04)
[3]类萜代谢工程研究进展及在烟草品种改良中的应用前景[J]. 崔红,宋志红. 中国烟草学报. 2003(02)
本文编号：3348323
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