亳菊抗旱转基因体系建立及抗旱性评价

发布时间：2017-04-29 13:03

  本文关键词：亳菊抗旱转基因体系建立及抗旱性评价，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：亳菊(Dendranthema morifolium'Bozhou')主要产于安徽省亳州市,是安徽省道地中药材,也是我国四大名菊之一。其花中含有的生物活性物质,如挥发油、黄酮类化合物等成分能疏风清阳、明目解毒,主治高血压,冠心病等,且具有抗癌、抗肿瘤等功效,也是常用饮料的主要添加调味剂之一,是药用和饮料兼用的中药材,具有很高的经济价值。一直被认为药用菊花中品质最好的亳菊由于种性退化严重、易感染、抗逆性弱等原因而面临极大的风险,真正的亳菊种植面积正在逐渐的减少。据统计,安徽省由于干旱导致的亳菊减产远多于其他非生物因素造成的减产的总和。因此,改良亳菊耐旱性水平是目前关键技术之一,但由于亳菊属高度杂合,常规的杂交等育种技术很难得到应用。本试验根据转基因技术原理,以亳菊茎段外植体为受体材料,抗草甘膦除草剂为筛选标记基因,通过发根农杆菌介导法转入EDT1抗旱基因,取得以下结果：1.通过热激转化法将工程载体质粒导入发根农杆菌A4中,对工程菌生长曲线测定结果表明,工程菌对数生长期在OD600=0.6左右。2.以草甘膦为筛选剂,设置50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400mg/L,5个浓度梯度,对亳菊组培苗致死率的研究表明,其最佳筛选浓度为100mg/L。3.通过农杆菌介导,对影响亳菊遗传转化效率的四个因素进行讨论：侵染时间、农杆菌菌液浓度、乙酰丁香酮浓度和共培养时间,在菌液浓度(OD600)为0.6-0.8,乙酰丁香酮浓度150μmol/L,侵染时间25 min,共培养3 d,除菌培养后,可得到15 d最大转化效率95.6%。4.剪取诱导产生的毛状根2 cm左右,转入愈伤组织诱导培养基中,诱导产生愈伤,两周继代培养-次,可以得到大量丛生芽。5.剪取2 cm左右丛生芽转接入生根培养基中,并在生根培养基中添加100mg/L的草甘膦作为筛选剂,无菌培养30 d,采用CTAB法,提取在添加筛选剂下能正常生长的植物叶片基因组DNA,通过聚合酶链式反应(PCR)检测,初步得到5株转基因植株。6.在干旱胁迫下,分别提取并测定毫菊叶片中的超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)的含量,结果表明,转基因植株相对于非转基因植株具有较高的耐旱性。
【关键词】：毫菊 发根农杆菌 EDT1 再生植株 抗氧化酶
【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S567.239
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 第1章 绪论9-20
• 1.1 中药资源概述9-11
• 1.1.1 菊花资源简介10-11
• 1.1.2 菊花主要药用成分11
• 1.2 亳菊研究概况11-12
• 1.2.1 亳菊性状简介11
• 1.2.2 亳菊研究现状11-12
• 1.3 植物基因工程技术在提高中药品质中的研究进展12-15
• 1.3.1 生产中药材有效成分13
• 1.3.2 提高中草药有效成分含量13-14
• 1.3.3 提供生物合成反应器原料14-15
• 1.3.4 提高中草药植物抗病性和抗逆性15
• 1.4 发根农杆菌在转基因转化体系中的应用15-16
• 1.5 AtEDT1/HDG11抗旱基因研究进展16-17
• 1.6 植物抗逆性研究概况17
• 1.7 药用植物转基因安全性17-18
• 1.8 本文研究的目的与意义18-19
• 1.8.1 研究目的18
• 1.8.2 研究内容18
• 1.8.3 研究意义18-19
• 1.9 创新点19-20
• 第2章 试验材料与方法20-27
• 2.1 试验材料20-21
• 2.1.1 植物材料20
• 2.1.2 转化菌株与工程载体质粒20
• 2.1.3 主要试验试剂20
• 2.1.4 主要试验仪器设备20-21
• 2.1.5 试验常用培养基21
• 2.2 试验方法21-27
• 2.2.1 植物材料无菌处理21-22
• 2.2.2 发根农杆菌A4活化与培养22
• 2.2.3 基因工程菌构建与生长曲线测定22-23
• 2.2.4 草甘膦有效筛选浓度实验23
• 2.2.5 发根农杆菌介导的遗传转化与植株再生23-24
• 2.2.6 碱裂解法提取农杆菌质粒24
• 2.2.7 植物基因组DNA提取(CTAB法)24-25
• 2.2.8 毛状根与再生植株PCR检测25-26
• 2.2.9 炼苗与草甘膦除草剂抗性检测26
• 2.2.10 亳菊叶片抗氧化酶活性与MDA含量的测定26
• 2.2.11 数据处理26-27
• 第3章 结果与分析27-40
• 3.1 工程农杆菌构建与生长曲线测定27-30
• 3.1.1 工程农杆菌菌筛选27-28
• 3.1.2 工程菌生长曲线测定28-30
• 3.2 目的基因PCR退火温度的优化30
• 3.3 草甘膦筛选浓度30-32
• 3.4 不同转化条件对毫菊遗传转化效率的影响32-33
• 3.5 毛状根诱导愈伤组织与植株再生33-35
• 3.6 再生植株初筛选与PCR检测35-36
• 3.6.1 毛状根的PCR检测35
• 3.6.2 再生植株抗性筛选与PCR检测35-36
• 3.7 抗性植株炼苗与抗草甘膦检测36-37
• 3.8 抗氧化酶活性与MDA含量测定37-40
• 第4章 讨论与结论40-43
• 4.1 讨论40-42
• 4.1.1 植物转基因工程研究中标记基因的选择40
• 4.1.2 植物遗传转化效率的影响因素40-41
• 4.1.3 植物抗旱性与生理生化指标的相关性41-42
• 4.1.4 药用植物转基因安全性42
• 4.2 结论42-43
• 展望43-45
• 参考文献45-51
• 附录51-53
• 致谢53-54
• 攻读硕士学位期间的学术成果54

【参考文献】

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本文编号：334892