外源KCS基因转化SAD过表达蛋白核小球藻及对脂肪酸组成影响的研究
发布时间：2021-08-19 20:50
为了探究3-酮脂酰-CoA合酶（KCS酶）对于小球藻脂肪酸代谢过程的调控作用,增加超长链不饱和脂肪酸的含量,本文采用农杆菌介导法将碎米荠KCS酶基因转入过表达硬脂酰载体蛋白去饱和酶（SAD酶）基因的改造蛋白核小球藻中,观察外源基因的转入对小球藻脂肪酸合成的影响。实验以pCAMBIA1301质粒为载体转化KCS基因,通过潮霉素抗性筛选阳性转化藻,用相同质粒载体转化GUS基因观察小球藻对所用表达盒的表达能力,采用PCR和RT-PCR验证碎米荠KCS酶基因阳性转化藻,利用高效液相色谱（HPLC）分析脂肪酸合成代谢中间产物,用气相色谱-质谱联用（GC-MS）法对其分析小球藻脂肪酸组成。本文所完成的基因转化是在前期完成了SAD基因转化的基础上通过农杆菌介导法进行的二次转化,首次获得了同时转化了SAD酶基因与KCS酶基因的蛋白核小球藻,并探究了KCS酶对小球藻脂肪酸合成的影响,为深入探究小球藻脂肪酸代谢的调控机理提供了研究参考。本研究的主要内容及结果如下:（1）成功构建了以双元载体pCAMBIA1301为基础,通过敲除GUS基因,连入碎米荠KCS基因改造而成的重组质粒pCAMBIA1301-KCS...
【文章来源】：广东海洋大学广东省
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
pCAMBIA1301载体图
胶上的电泳产物进行回收。.3.4 基因连接利用 T4 连接酶试剂盒，将经过 BglII 和 BsteII 双酶切的 pCAMBIA1301 线段和外源 KCS 基因进行连接，用外源 KCS 基因取代 GUS 基因所在位置，重组质粒（见图 3-2），操作步骤参照试剂盒说明书，反应体系见表 2-3，反应。表 2-3 连接反应体系Tab 2-3 Reaction system of ligation组分 20μl 反应体系载体 DNA+目的片段 9μL10×Ligation Buffer 1μlT4 DNA Ligase,5U/μl 0.5μl灭菌 dd H2O 加至 10μL
广东海洋大学硕士学位论文讨论PCR 鉴定抗性平板上挑取的重组质粒 pCAMBIA1301-KCS 阳性转化子定，结果见图 2-3。示，泳道 6 为野生大肠杆菌的 PCR 产物，作为阴性对照，泳的菌落 PCR 产物电泳结果，其中除阴性对照外皆出现了条带近，扩增片段为 116bp，与预期相符合。由 PCR 结果可知，外转化入大肠杆菌中，即转化进入大肠杆菌细胞内的是构建成功BIA1301-KCS。
【参考文献】：
期刊论文
[1]烟草高级脂肪酸代谢及影响因素研究进展[J]. 杨利云,杨双龙,李军营,逄涛,何彬,龚明. 生物技术通报. 2017(12)
[2]农杆菌介导的马铃薯转化研究进展[J]. 张丽,宋玉霞,巩檑,颉瑞霞,甘晓燕,石磊,聂峰杰,陈虞超,张国辉. 分子植物育种. 2015(07)
[3]农杆菌介导的烟草瞬时表达影响因素研究[J]. 孙蔓莉,孟玉玲,张强,黄桂艳,单卫星. 西北农业学报. 2015(01)
[4]农杆菌介导AVP1基因转化甜菜[J]. 王晓娇,孙亚卿,李国龙,温丽,张少英. 分子植物育种. 2011(03)
[5]利用基因工程改良植物脂肪酸和提高植物含油量的研究进展[J]. 夏晗,王兴军,李孟军,肖寒. 生物工程学报. 2010(06)
[6]链格孢ATMT转化体系的构建及弱毒突变株验证[J]. 徐后娟,徐荣燕,李多川. 基因组学与应用生物学. 2009(06)
[7]小球藻核rDNA ITS与叶绿体rbcL基因序列分析及应用[J]. 孙雪,吴晓微,李兴文,裴鲁青. 水产学报. 2009(04)
[8]农杆菌介导大豆遗传转化研究进展及转基因作物现状[J]. 练云,梁慧珍,王树峰,余永亮,王庭峰,位艳丽. 大豆科学. 2009(03)
[9]小球藻psbA基因的克隆与序列分析[J]. 吴晓微,孙雪,陆开形,汪一冰,张晓龙. 水产科学. 2008(07)
[10]植物超长链脂肪酸及角质层蜡质生物合成相关酶基因研究现状[J]. 倪郁,郭彦军. 遗传. 2008(05)
博士论文
[1]转基因絮凝斜生栅藻的构建和自絮凝斜生栅藻细胞絮凝的研究[D]. 郭锁莲.大连理工大学 2013
硕士论文
[1]外源SAD基因在蛋白核小球藻中转化和表达及对脂肪酸组成的影响[D]. 杨青峰.广东海洋大学 2017
[2]菊花去饱和酶基因CmSAD的克隆与表达分析[D]. 李静.河南农业大学 2016
[3]三角褐指藻遗传转化表达体系的建立[D]. 张梦晗.暨南大学 2013
[4]转植酸酶基因海水小球藻培养条件研究[D]. 左明.大连理工大学 2008
[5]莱茵衣藻外源基因高效转化系统的建立及金藻转化方法的研究[D]. 曹军平.中国农业科学院 2000
本文编号：3352121
【文章来源】：广东海洋大学广东省
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
pCAMBIA1301载体图
胶上的电泳产物进行回收。.3.4 基因连接利用 T4 连接酶试剂盒，将经过 BglII 和 BsteII 双酶切的 pCAMBIA1301 线段和外源 KCS 基因进行连接，用外源 KCS 基因取代 GUS 基因所在位置，重组质粒（见图 3-2），操作步骤参照试剂盒说明书，反应体系见表 2-3，反应。表 2-3 连接反应体系Tab 2-3 Reaction system of ligation组分 20μl 反应体系载体 DNA+目的片段 9μL10×Ligation Buffer 1μlT4 DNA Ligase,5U/μl 0.5μl灭菌 dd H2O 加至 10μL
广东海洋大学硕士学位论文讨论PCR 鉴定抗性平板上挑取的重组质粒 pCAMBIA1301-KCS 阳性转化子定，结果见图 2-3。示，泳道 6 为野生大肠杆菌的 PCR 产物，作为阴性对照，泳的菌落 PCR 产物电泳结果，其中除阴性对照外皆出现了条带近，扩增片段为 116bp，与预期相符合。由 PCR 结果可知，外转化入大肠杆菌中，即转化进入大肠杆菌细胞内的是构建成功BIA1301-KCS。
【参考文献】：
期刊论文
[1]烟草高级脂肪酸代谢及影响因素研究进展[J]. 杨利云,杨双龙,李军营,逄涛,何彬,龚明. 生物技术通报. 2017(12)
[2]农杆菌介导的马铃薯转化研究进展[J]. 张丽,宋玉霞,巩檑,颉瑞霞,甘晓燕,石磊,聂峰杰,陈虞超,张国辉. 分子植物育种. 2015(07)
[3]农杆菌介导的烟草瞬时表达影响因素研究[J]. 孙蔓莉,孟玉玲,张强,黄桂艳,单卫星. 西北农业学报. 2015(01)
[4]农杆菌介导AVP1基因转化甜菜[J]. 王晓娇,孙亚卿,李国龙,温丽,张少英. 分子植物育种. 2011(03)
[5]利用基因工程改良植物脂肪酸和提高植物含油量的研究进展[J]. 夏晗,王兴军,李孟军,肖寒. 生物工程学报. 2010(06)
[6]链格孢ATMT转化体系的构建及弱毒突变株验证[J]. 徐后娟,徐荣燕,李多川. 基因组学与应用生物学. 2009(06)
[7]小球藻核rDNA ITS与叶绿体rbcL基因序列分析及应用[J]. 孙雪,吴晓微,李兴文,裴鲁青. 水产学报. 2009(04)
[8]农杆菌介导大豆遗传转化研究进展及转基因作物现状[J]. 练云,梁慧珍,王树峰,余永亮,王庭峰,位艳丽. 大豆科学. 2009(03)
[9]小球藻psbA基因的克隆与序列分析[J]. 吴晓微,孙雪,陆开形,汪一冰,张晓龙. 水产科学. 2008(07)
[10]植物超长链脂肪酸及角质层蜡质生物合成相关酶基因研究现状[J]. 倪郁,郭彦军. 遗传. 2008(05)
博士论文
[1]转基因絮凝斜生栅藻的构建和自絮凝斜生栅藻细胞絮凝的研究[D]. 郭锁莲.大连理工大学 2013
硕士论文
[1]外源SAD基因在蛋白核小球藻中转化和表达及对脂肪酸组成的影响[D]. 杨青峰.广东海洋大学 2017
[2]菊花去饱和酶基因CmSAD的克隆与表达分析[D]. 李静.河南农业大学 2016
[3]三角褐指藻遗传转化表达体系的建立[D]. 张梦晗.暨南大学 2013
[4]转植酸酶基因海水小球藻培养条件研究[D]. 左明.大连理工大学 2008
[5]莱茵衣藻外源基因高效转化系统的建立及金藻转化方法的研究[D]. 曹军平.中国农业科学院 2000
本文编号：3352121
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3352121.html
最近更新
教材专著
