Toll样受体4（TLR4）基因剔除小鼠构建及初步表型分析

发布时间：2021-08-24 17:27

　　目的:利用CRISPR/Cas9技术构建Toll样受体4（TLR4）基因敲除小鼠模型,并观察突变小鼠对革兰氏阴性细菌脂多糖（LPS）刺激响应的变化。方法:针对TLR4基因外显子2设计并合成1对sgRNA片段,与编码Cas9的mRNA混合后通过受精卵显微注射方法,建立TLR4基因敲除小鼠,通过繁育获得基因敲除纯合子小鼠（TLR4-/-小鼠）;通过LPS刺激,分析TLR4-/-小鼠对炎症应激的反应情况,并在分子和病理水平上和野生型对照（WT）进行比较。结果:PCR及测序检测表明TLR4基因外显子2在小鼠基因中被成功敲除;给予LPS刺激后,IL1β、IL6、My D88、i NOS及TNFa等炎症因子的表达在野生型小鼠的心、肝和肺组织中显著上调,而在TLR4-/-小鼠中则几乎没有变化;血生化指标显示LPS刺激后WT小鼠血清中的尿素（Urea）和肌酐（Cre）水平显著升高,而TLR4-/-小鼠刺激前后无显著变化,病理分析同样发现TLR4-/-小鼠能够抵抗LPS对肾组织的损伤。结论:利用CRISPR/Cas9技术成功构建了TLR4基因剔除小鼠模型,TLR4的缺失能够降低IL1β、IL6、My D... 

【文章来源】：中国生物工程杂志. 2020,40(06)北大核心CSCD

【文章页数】：9 页

【部分图文】：

TLR4-/-小鼠基因敲除策略

TLR4基因敲除小鼠基因型鉴定结果

实时定量PCR检测了LPS刺激前后TLR4及下游基因在小鼠各组织中mRNA表达水平，结果如图3显示，将PCR引物设计在敲除的外显子2区域内，在野生型小鼠中可以检测到明显的TLR4信号，并能检测到LPS刺激后的显著上调，但在LPS刺激前后TLR4-/-小鼠的组织中未能够检测到TLR4基因的信号，说明在mRNA水平实现了对TLR4基因目的片段的敲除;对LPS刺激后，TLR4-/-小鼠的心、肝、肺组织中TLR4参与调节的IL1β、IL6、My D88、i NOS及TNFa等下游响应基因的表达均显著低于同窝野生型，尤其是IL6的表达在LPS刺激后的TLR4-/-小鼠中几乎检测不到。采用Western blot和ELISA进一步对TLR4下游基因i NOS、TNF-α和IL-6的表达进行验证。LPS刺激前WT和TLR4-/-小鼠的肝脏组织均未有i NOS阳性条带显示，LPS刺激后仅有WT小鼠中检测到i NOS表达的阳性条带(图4a)。血清中TNF-α和IL-6的检测数据如图4b所示，LPS刺激前WT和TLR4-/-小鼠的血清中均未检测出TNF-α和IL-6,LPS刺激后WT小鼠血清中TNF-α和IL-6表达显著上调，分别达到168.759±39.285pg/ml和675.630±133.246ng/ml，但依然无法在TLR4-/-小鼠的血清中检测到两者的表达。图4 LPS刺激前后TLR4-/-小鼠i NOS,TNF-α和IL-6表达检测


本文编号：3360417