慢病毒载体介导B型血友病基因治疗研究
发布时间：2021-08-24 18:10
血友病B（Hemophilia B,HB）是X连锁单基因缺陷疾病,由于FⅨ基因的突变导致凝血因子IX（Factor IX,FⅨ）的缺陷,或者生成无活性FⅨ。FⅨ是一种凝血因子,在发生凝血反应时,被活化的FⅨ可以将凝血酶原激活成为凝血酶发挥凝血功能。目前,临床上使用药物替代疗法,将FⅨ蛋白直接注射到患者血液中,以维持体内的凝血功能,但是这种治疗手段成本高,治疗时间长,需要持续用药。干细胞移植是目前正在发展的有效治疗手段,通过对患者体内提取出来的干细胞进行体外基因纠正,再回输到患者体内,让其在患者体内表达活性FⅨ,从而达到治疗效果。间充质干细胞（Mesenchymal stem cell,MSC）也是干细胞来源,它遍布于人体每个器官组织,具有多向分化潜能,是细胞治疗的良好细胞载体,因此本研究使用人源MSC作为治疗细胞,探究LV-FⅨ在MSC中的表达情况。本研究首先构建LV-EF1α-FⅨ,用于探究MSC表达外源FⅨ的情况。表达检测结果表示,启动子EF1α可以在两种人源MSCs（FT902和1207-9）中高效启动表达FⅨ,并分泌到胞外表现出一定的凝血功能。FⅨ的蛋白修饰检测表明,由MSC表...
【文章来源】：电子科技大学四川省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
凝血机制图
第一章绪论5可以应用于绝大多数的基因缺陷疾玻常用的治疗策略见图1-3。图1-3慢病毒介导基因治疗策略1.5MSC的介绍及其相关应用MSC是一种非造血干细胞，具有高度自我复制的能力和多重分化潜能[19]。多分布于各个组织和器官中。目前已有多个组织被证实可以提取出MSC：骨髓[20]、脐带血[21]、羊膜囊[22]、胎盘[23]、牙组织[24]。不同来源的MSC生物性质有所差异，但也有类似的生物性质用于区分定义，比如MSC表面抗原，阳性：CD73+、CD90+、CD105+；阴性:CD34-、CD45-、CD11b-；其次，MSC具有分化成软骨、脂肪和成骨的能力，也是定义MSC的标准之一。MSC本身具有免疫调节的特性和组织修复的能力，免疫调节功能[25]和组织修复功能，早期临床实验使用MSC来治疗移植物抗宿主病（GVHD），可以有效调节移植物在宿主体内的免疫排斥[26]。在血友病领域，MSC作为治疗基因的载体，应用相对较少。到目前为止，已有文献使用不同组织来源的MSC在体外进行外源FIX的表达：骨髓[20]、脂肪[27]、脐带血[28]。在动物模型中，干细胞移植更偏向于使用HSC，因为HSC是血液系统的细胞，具有良好的血液相容性，通过静脉注射到血管中的HSC可以长时间存在于血液中分化增殖。而MSC属于组织干细胞，血液相容性差，通过静脉移
第三章LV-EF1α-FIX在MSC中的表达25图3-1LV-EF1α-FIX的VCN通过对LV-EF1α-FIX进行病毒Titer的检测，结果表明病毒Titer可以高达3×109~4×109，说明在1mL的病毒液中，具有活性的病毒数量为3×109~4×109，验证了慢病毒包装系统效率高，完全具备应用于基因治疗研究的能力。3.2.2转染细胞VCN检测FT902和1207-9两种人源MSC细胞系分别来源于胚胎胸腺组织和胚胎足部组织。通过人源端粒酶基因（HumanTelomeraseReverseTranscriptase,hTERT）的转染使其具备永生化的特性，形成MSC细胞系。经过LV-EF1α-FIX的转染，方法如2.4.3.1.所示，我们在转染后第七天左右收集约1×106细胞进行DNA的提取和VCN的检测，方法如2.3.4所示。结果如图3-2所示。图3-2转染细胞VCN检测VCN结果表示，两种MSCs在经过LV-EF1α-FIX转染后，VCN可以稳定在100%~200%，即平均一个细胞中具备1个至2个病毒拷贝数，符合我们的预期。因为在测试中发现高VCN的细胞状态不好。
本文编号：3360476
【文章来源】：电子科技大学四川省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
凝血机制图
第一章绪论5可以应用于绝大多数的基因缺陷疾玻常用的治疗策略见图1-3。图1-3慢病毒介导基因治疗策略1.5MSC的介绍及其相关应用MSC是一种非造血干细胞，具有高度自我复制的能力和多重分化潜能[19]。多分布于各个组织和器官中。目前已有多个组织被证实可以提取出MSC：骨髓[20]、脐带血[21]、羊膜囊[22]、胎盘[23]、牙组织[24]。不同来源的MSC生物性质有所差异，但也有类似的生物性质用于区分定义，比如MSC表面抗原，阳性：CD73+、CD90+、CD105+；阴性:CD34-、CD45-、CD11b-；其次，MSC具有分化成软骨、脂肪和成骨的能力，也是定义MSC的标准之一。MSC本身具有免疫调节的特性和组织修复的能力，免疫调节功能[25]和组织修复功能，早期临床实验使用MSC来治疗移植物抗宿主病（GVHD），可以有效调节移植物在宿主体内的免疫排斥[26]。在血友病领域，MSC作为治疗基因的载体，应用相对较少。到目前为止，已有文献使用不同组织来源的MSC在体外进行外源FIX的表达：骨髓[20]、脂肪[27]、脐带血[28]。在动物模型中，干细胞移植更偏向于使用HSC，因为HSC是血液系统的细胞，具有良好的血液相容性，通过静脉注射到血管中的HSC可以长时间存在于血液中分化增殖。而MSC属于组织干细胞，血液相容性差，通过静脉移
第三章LV-EF1α-FIX在MSC中的表达25图3-1LV-EF1α-FIX的VCN通过对LV-EF1α-FIX进行病毒Titer的检测，结果表明病毒Titer可以高达3×109~4×109，说明在1mL的病毒液中，具有活性的病毒数量为3×109~4×109，验证了慢病毒包装系统效率高，完全具备应用于基因治疗研究的能力。3.2.2转染细胞VCN检测FT902和1207-9两种人源MSC细胞系分别来源于胚胎胸腺组织和胚胎足部组织。通过人源端粒酶基因（HumanTelomeraseReverseTranscriptase,hTERT）的转染使其具备永生化的特性，形成MSC细胞系。经过LV-EF1α-FIX的转染，方法如2.4.3.1.所示，我们在转染后第七天左右收集约1×106细胞进行DNA的提取和VCN的检测，方法如2.3.4所示。结果如图3-2所示。图3-2转染细胞VCN检测VCN结果表示，两种MSCs在经过LV-EF1α-FIX转染后，VCN可以稳定在100%~200%，即平均一个细胞中具备1个至2个病毒拷贝数，符合我们的预期。因为在测试中发现高VCN的细胞状态不好。
本文编号：3360476
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