小鼠GABRR2基因克隆表达及CRISPR/Cas9介导的基因编辑
发布时间：2021-08-26 05:17
背景GABA是哺乳类动物中枢神经系统主要的抑制性神经递质,GABA受体也是临床上重要的神经活性化合物的主要靶点。GABAc受体是视网膜组织中关键的调节性受体,研究表明,激活的GABAC受体能够抑制双极神经元与神经节细胞之间的谷氨酸释放,以此来调节视网膜的动态变化。视网膜病变引起的视神经疾病是眼科疾病中的急症和重症,对视网膜病变这一大类视神经病变过程中的新靶标、新途径的研究仍不全面。本研究应用小鼠视网膜神经节细胞（RGC-5）成功构建GABAc受体Rho2基因（GABRR2）过表达及敲除细胞系,建立了GABAC离子通道结构及功能筛选平台,为体外阐述GABAC受体结构功能以及受体同药物的相互作用奠定基础,以期为疾病干预和药物设计提供新靶标和新思路。目的构建GABRR2基因过表达稳定细胞系以及GABRR2基因敲除细胞系,研究基因编辑后的双倍体成体细胞详细的基因型与表现型,以及基因编辑对GABRR2基因外显子剪切的作用。方法（1）分别以pCMV6-Entry-mRho2以及p IRES-e GFP表达质粒为模板,通过快速克隆法构建质粒,利用Lipo6000TM转染试剂转染...
【文章来源】：新乡医学院河南省
【文章页数】：83 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
PCR凝胶电泳图
A. M: DNAmarker; 1: Identification of PCR products of pIRES-eGFP;B. M: DNAmarker; 2: Identification of PCR products of mRho2;C. M: DNAmarker; 2:Identification of colony PCR of positive clone ;1.3.4: Identification of colony PCR of negative clones.ABRR2 基因过表达稳定细胞系的构建用Lipo6000TM转染试剂将pIRES2-eGFP-mRho2重组质粒导入视网膜神经节C-5 中，转染 48 h 后，荧光显微镜下观察转染效率，再利用有限稀释法进行选，筛选出单克隆细胞，扩大培养，以获得稳定表达 GABRR2 的细胞系，为 GABRR2 过表达细胞系。以野生型 RGC-5 细胞作为阴性对照，在倒置荧下进行观察，野生型 RGC-5 细胞无荧光（图 1-2-A），而过表达细胞系可清到存在较强绿色荧光（图 1-2-B），表明重组 mRho2 质粒已在 RGC-5 细胞达。
A: 野生型 RGC-5 细胞系明视野；B：野生型 RGC-5 细胞荧光视野；C: 过表达 RGC-5 细胞系明视野；D：过表达 RGC-5 细胞系荧光视野Fig 1-2. The image of cells after transfection and selection(×200).A: Wild type cell line in bright field; B: Wild type cell line in fluorescence field;: Overexpression cell line in bright field; D:Overexpression cell line in fluorescence field.3 流式细胞术检测稳定表达 GABRR2 的 RGC-5 细胞数量流式细胞仪检测 GABRR2 过表达细胞系中 GFP 阳性细胞数量。以野生型 RGC-5 胞 作 为 阴 性 对 照 ， 结 果 显 示 在 收 集 的 1×104个 细 胞 中 ， 稳 定 转 染RES2-eGFP-mRho2 质粒的 RGC-5 细胞中 GFP 阳性细胞占 97%，而野生型 RGC-5胞中 GFP 阳性细胞比例为 0。
【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas9 and Genome Editing in Drosophila[J]. Andrew R.Bassett,Ji-Long Liu. Journal of Genetics and Genomics. 2014(01)
本文编号：3363625
【文章来源】：新乡医学院河南省
【文章页数】：83 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
PCR凝胶电泳图
A. M: DNAmarker; 1: Identification of PCR products of pIRES-eGFP;B. M: DNAmarker; 2: Identification of PCR products of mRho2;C. M: DNAmarker; 2:Identification of colony PCR of positive clone ;1.3.4: Identification of colony PCR of negative clones.ABRR2 基因过表达稳定细胞系的构建用Lipo6000TM转染试剂将pIRES2-eGFP-mRho2重组质粒导入视网膜神经节C-5 中，转染 48 h 后，荧光显微镜下观察转染效率，再利用有限稀释法进行选，筛选出单克隆细胞，扩大培养，以获得稳定表达 GABRR2 的细胞系，为 GABRR2 过表达细胞系。以野生型 RGC-5 细胞作为阴性对照，在倒置荧下进行观察，野生型 RGC-5 细胞无荧光（图 1-2-A），而过表达细胞系可清到存在较强绿色荧光（图 1-2-B），表明重组 mRho2 质粒已在 RGC-5 细胞达。
A: 野生型 RGC-5 细胞系明视野；B：野生型 RGC-5 细胞荧光视野；C: 过表达 RGC-5 细胞系明视野；D：过表达 RGC-5 细胞系荧光视野Fig 1-2. The image of cells after transfection and selection(×200).A: Wild type cell line in bright field; B: Wild type cell line in fluorescence field;: Overexpression cell line in bright field; D:Overexpression cell line in fluorescence field.3 流式细胞术检测稳定表达 GABRR2 的 RGC-5 细胞数量流式细胞仪检测 GABRR2 过表达细胞系中 GFP 阳性细胞数量。以野生型 RGC-5 胞 作 为 阴 性 对 照 ， 结 果 显 示 在 收 集 的 1×104个 细 胞 中 ， 稳 定 转 染RES2-eGFP-mRho2 质粒的 RGC-5 细胞中 GFP 阳性细胞占 97%，而野生型 RGC-5胞中 GFP 阳性细胞比例为 0。
【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas9 and Genome Editing in Drosophila[J]. Andrew R.Bassett,Ji-Long Liu. Journal of Genetics and Genomics. 2014(01)
本文编号：3363625
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3363625.html
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