基因克隆及活性多肽表达与纯化方法学研究

发布时间：2021-08-27 01:23

　　离子通道（受体）（例如电压门控通道、机械门控通道和配体门控通道等）在许多生物体内的生理活性中起着非常重要的作用。离子通道（受体）的功能异常或者功能失常会导致许多疾病的发生,例如慢性疼痛、心脏或脑疾病、关节炎以及运动障碍等。天然多肽（2-50个氨基酸分子）可以作为调节分子与离子通道（受体）分子相互作用。对于活性多肽功能高通量的活性研究最重要的两个限速步骤为:1)是否能够快速的进行基因克隆操作,在较短的时间内构建大量的表达载体;2)该表达载体是否能够获得二硫键正确折叠的活性多肽。针对这两个瓶颈,本论文首先建立了一种新的基因克隆方法——OEPR克隆,其最重要的特点就是OEPR克隆把基于重叠延伸PCR方法和基于同源重组的方法完美地结合到了一起。OEPR克隆通过在插入基因的上游引物和下游引物的5’端分别引入一段与载体插入位点同源的序列。上游引物5’端引入的同源序列为15-30个碱基,用于同源重组反应;下游引物5’端引入的同源序列的Tm值为68-70℃,用于重叠延伸PCR反应。通过两步PCR反应之后,可以获得一条线性的目的质粒,其两端具有一段同源序列（15-30 bp）,可以帮助其在大肠杆菌体内被... 

【文章来源】：国防科技大学湖南省 211工程院校 985工程院校

【文章页数】：173 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

通过重叠延伸PCR进行剪切或者多位点点突变示意图

上面一行表示正义链，下面一行表示反义链。在第一轮 PCR（图）中，分别使用引物引物对 F1F 和 F1RT、F2FT 和 F2RT 以及 F3FT应的 DNA 片段获得 DNA 扩增产物 F1、F2 和 F3。 F1 在 3’末端添（蓝色），F2 在 5’末端（蓝色）和 3’末端（绿色）添加了尾部序 5’端添加了尾部序列（绿色）。在第二轮 PCR（图 1.1D）中，在CR 混合物中依次加入 F1、F2 和 F3，然后在一个反应管中使用引物增全长 DNA[2]。叠延伸 PCR 不依赖于任何的限制性酶切位点，任何两个片段都可以自由拼接在一起。基于重叠延伸 PCR 技术，多个 DNA 片段可以同一起，目前已获得的最大拼接片段超过 20 kbp[3]。通过重叠延伸 P序列中引入突变、删除和替换等[4,5]，全基因合成也可以通过重叠延若干个短的相互重叠的引物拼接成全长的基因序列[6,7]。重叠延伸 P行基因的剪切与引入多位点点突变的实验[2,8]。1.2 基于定点突变的无缝连接克隆

IFPC克隆技术原理示意图


本文编号：3365358