CRISPR/Cas9基因编辑技术介导SST基因敲除细胞的制备

发布时间：2021-08-27 02:36

　　利用CRISPR/Cas9基因编辑技术制备了SST基因敲除的细胞。在猪SST基因第一外显子区域设计2个向导RNA （sgRNA）,用PX459构建成表达质粒,电转染猪胎儿的成纤维细胞,在48 h后用嘌呤霉素筛选细胞。通过PCR扩增、测序检测,在获得的13个克隆中,有2株细胞未检测到基因敲除,4株细胞发生单等位基因敲除,7株细胞为双等位基因删除。筛选到的纯合子单克隆细胞可用于制备SST基因删除猪。 

【文章来源】：江西农业学报. 2020,32(08)

【文章页数】：6 页

【部分图文】：

质粒构建信息图

经过7 d左右的培养,当成纤维细胞在组织块周围长成片并且汇合度逐渐达到90%时,将组织块挑去可获得原代细胞。肾成纤维细胞生长状态较好,呈梭形,在显微镜下观察,其细胞透明,边缘清晰(图2)。在传代后生长迅速,2～3 d即可长满6孔板。转染前1 d消化细胞传代后,转染时细胞即处于对数生长期,活力最好,转染效果最佳。2.2 质粒构建的结果

将E1-1、E1-2分别与线性化的PX459质粒链接,然后用限制性内切酶验证打靶质粒。设计用KPnⅠ+ApaⅠ双酶切,酶切后两条带大小分别为2288和6886 bp。琼脂糖凝胶电泳结果(图3)显示片段大小与预期一致,只是质粒浓度较高,部分未酶切。将酶切验证后的质粒扩繁,提取菌液的质粒,经过公司测序,测序结构如图3所示,sgRNA插入的方向、位置与预期相符,质粒构建成功。

【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3365477