杀鱼爱德华氏菌uhpA基因缺失株构建及其生物学特性分析
发布时间：2021-08-28 00:44
杀鱼爱德华氏菌（E.piscicida）是一种革兰氏阴性、短杆状细菌,属肠杆菌科。广泛分布在水生环境中,是一种条件性致病菌,可以感染多种鱼类,导致一种称为爱德华氏菌病的全身性疾病,并对全世界的渔业经济造成巨大损失。研究发现,杀鱼爱德华氏菌（E.piscicida）是一种侵入性肠道细菌,肠道中丰富的岩藻糖可以调节FusKR的双组分系统,促进其他基因,尤其是III型分泌系统（T3SS）等毒力基因的表达,对细菌的致病性具有重要作用。相关研究证实6-磷酸葡萄糖调控uhpA/uhpB双组分系统,并进一步调控其他毒力基因,但uhpA基因对岩藻糖激活FusKR相关基因和T3SS等毒力基因及其作用机制研究尚不明确。所以,拟构建杀鱼爱德华氏菌EIB202菌株的uhpA基因的缺失株ΔuhpA,通过与杀鱼爱德华氏菌野毒株差异比较,研究uhpA/uhpB双组分系统uhpA基因的功能。首先应用同源重组的方法构建了杀鱼爱德华氏菌EIB202菌株的uhpA基因缺失株ΔuhpA时。通过与野生株比较发现,6-磷酸葡萄糖显著增加了杀鱼爱德华氏菌野生株EIB202的生长速度（P<0.05）;添加6-磷酸葡萄糖作为营养...
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：73 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
斑马鱼
图 2 生成并鉴定了在杀鱼爱德华氏菌 EIB202 中基因 uhpA 的缺失。A：uhpA 的上游（泳道 1）和下游（泳道 2）片段的 PCR 扩增；B：uhpA 的上游和下游片段的重叠 PCR；C：携带 pDMK-uhpA 的 SM10 的 PCR 验证；D: pDMK-uhpA 质粒双酶切验证；E：携带 pDMK-uhpA 的 EIB202 的PCR 验证；F：使用引物 PW-F 和 PW-R 从 EIB202（泳道 2）或ΔuhpA（泳道 1）扩增的 PCR 产物。Fig.2 The deletion of gene uhpA in E. piscicida EIB202 was generated and identified.A: PCR amplication of upstream (lane 1) and downstream (lane 2) fragments of uhpA ;B: Overlap PCR of upstream anddownstream fragments of uhpA ;C: PCR verification of SM10 carrying pDMK-uhpA;D: pDMK-uhpAplasmid doubleenzyme digestion verification;E: PCR verification of EIB202 carrying pDMK-uhpA;F: PCR product amplified from EIB202(lane 1) or ΔuhpA (lane 2) using primers PW-F and PW-R.3.2 杀鱼爱德华氏菌 EIB202 株与ΔuhpA 株生长曲线通过检测杀鱼爱德华氏菌 EIB202 和ΔuhpA 菌株在含有或不含 20 mM 6-磷酸葡萄糖的α-MEM 中生长。加了 6-磷酸葡萄糖作为营养源的野生株 EIB202 比加了 6-磷酸葡萄糖作为营养源的缺失株和不加 6-磷酸葡萄糖作为营养源的野生株和缺失株表现出显著生长（P <0.05）（见图 2）。
3 在具有和不具有 20 mM 6-磷酸葡萄糖的α-MEM 培养基中经过 24 小时生长迟滞 E. piscicida EIB202 和ΔuFig.3 Growth of E. piscicida EIB202 and ΔuhpA in α-MEM medium with and without 20 mM G-6-P over 24h. 动物攻毒试验结果.1 半数致死量（LD50）结果通过一周的观察，对照组全部存活，试验组存活情况见表 7 与表 8。按照 Reed-Muench 方法计算可得，野生株的 LD50值 1×105CFU/fish，突变株 uhp50值为 2×104CFU/fish。对照组在试验过程中没有死亡现象。表 6 EIB202 组存活情况统计Table6 Survival statistics of group EIB202释度 感染数 存活数 死亡数 累计总数 死亡比（死亡总数/总数）死亡率存活数 死亡数10010 0 10 0 18 18/18 100-110 4 6 4 8 8/12 66
【参考文献】：
期刊论文
[1]大菱鲆早期发育过程中免疫器官的发生[J]. 佟雪红,徐世宏,刘清华,李军,肖志忠,马道远. 海洋科学. 2011(06)
[2]迟缓爱德华氏菌及其致病机理[J]. 王波,莫照兰. 海洋科学集刊. 2007(00)
[3]鱼类营养免疫研究进展[J]. 艾庆辉,麦康森. 水生生物学报. 2007(03)
[4]海水工厂化养殖大菱鲆（Scophthalmus maximus）和褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）腹水病病原菌的分离与鉴定[J]. 薛淑霞,冯守明,孙金生. 海洋与湖沼. 2006(06)
[5]养殖大菱鲆腹水病病原的研究[J]. 李筠,颜显辉,陈吉祥,王印庚,李秋芬. 中国海洋大学学报(自然科学版). 2006(04)
[6]鱼类免疫机制及其影响因子[J]. 张艳秋,詹勇,许梓荣. 水产养殖. 2005(03)
[7]鲤鱼爱德华氏菌败血症的诊断和防治[J]. 张超睿,王可之,杨新山,高林. 内陆水产. 2002(08)
[8]海洋鱼病疫苗开发与生物反应器大规模生产[J]. 张元兴,马悦,孙修勤. 高技术通讯. 2000(02)
[9]鳗鲡爱德华菌病的诊断和病原学研究[J]. 薄清如,黄新民,郑帆,马珊珊,胡木枝,兰乃洪,黄建珍,廖春华,张远国. 中国兽医学报. 1999(03)
[10]迟缓爱德华氏菌的粘附特性[J]. 欧阳志明,陈怀青,陆承平. 南京农业大学学报. 1997(03)
博士论文
[1]迟钝爱德华氏菌双组分系统的毒力调控机制[D]. 吕远志.华东理工大学 2013
[2]迟钝爱德华氏菌双组份系统EsrA-EsrB和QseB-QseC的毒力调控机制[D]. 王鑫.华东理工大学 2011
[3]迟缓爱德华菌菌蜕疫苗的构建及动物免疫试验[D]. 王雪鹏.南京农业大学 2009
硕士论文
[1]杀鱼爱德华氏菌中Fur和EsrB对其生理和代谢的调控机制[D]. 赵路遥.华东理工大学 2017
[2]迟缓爱德华菌弱毒株的分离鉴定及对罗非鱼的免疫保护效果研究[D]. 庞晓茹.山东农业大学 2016
[3]迟钝爱德华氏菌活性氧抗性、双组分系统QseEF及三型分泌系统相关基因的功能鉴定[D]. 陈涛.华东理工大学 2011
本文编号：3367437
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：73 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
斑马鱼
图 2 生成并鉴定了在杀鱼爱德华氏菌 EIB202 中基因 uhpA 的缺失。A：uhpA 的上游（泳道 1）和下游（泳道 2）片段的 PCR 扩增；B：uhpA 的上游和下游片段的重叠 PCR；C：携带 pDMK-uhpA 的 SM10 的 PCR 验证；D: pDMK-uhpA 质粒双酶切验证；E：携带 pDMK-uhpA 的 EIB202 的PCR 验证；F：使用引物 PW-F 和 PW-R 从 EIB202（泳道 2）或ΔuhpA（泳道 1）扩增的 PCR 产物。Fig.2 The deletion of gene uhpA in E. piscicida EIB202 was generated and identified.A: PCR amplication of upstream (lane 1) and downstream (lane 2) fragments of uhpA ;B: Overlap PCR of upstream anddownstream fragments of uhpA ;C: PCR verification of SM10 carrying pDMK-uhpA;D: pDMK-uhpAplasmid doubleenzyme digestion verification;E: PCR verification of EIB202 carrying pDMK-uhpA;F: PCR product amplified from EIB202(lane 1) or ΔuhpA (lane 2) using primers PW-F and PW-R.3.2 杀鱼爱德华氏菌 EIB202 株与ΔuhpA 株生长曲线通过检测杀鱼爱德华氏菌 EIB202 和ΔuhpA 菌株在含有或不含 20 mM 6-磷酸葡萄糖的α-MEM 中生长。加了 6-磷酸葡萄糖作为营养源的野生株 EIB202 比加了 6-磷酸葡萄糖作为营养源的缺失株和不加 6-磷酸葡萄糖作为营养源的野生株和缺失株表现出显著生长（P <0.05）（见图 2）。
3 在具有和不具有 20 mM 6-磷酸葡萄糖的α-MEM 培养基中经过 24 小时生长迟滞 E. piscicida EIB202 和ΔuFig.3 Growth of E. piscicida EIB202 and ΔuhpA in α-MEM medium with and without 20 mM G-6-P over 24h. 动物攻毒试验结果.1 半数致死量（LD50）结果通过一周的观察，对照组全部存活，试验组存活情况见表 7 与表 8。按照 Reed-Muench 方法计算可得，野生株的 LD50值 1×105CFU/fish，突变株 uhp50值为 2×104CFU/fish。对照组在试验过程中没有死亡现象。表 6 EIB202 组存活情况统计Table6 Survival statistics of group EIB202释度 感染数 存活数 死亡数 累计总数 死亡比（死亡总数/总数）死亡率存活数 死亡数10010 0 10 0 18 18/18 100-110 4 6 4 8 8/12 66
【参考文献】：
期刊论文
[1]大菱鲆早期发育过程中免疫器官的发生[J]. 佟雪红,徐世宏,刘清华,李军,肖志忠,马道远. 海洋科学. 2011(06)
[2]迟缓爱德华氏菌及其致病机理[J]. 王波,莫照兰. 海洋科学集刊. 2007(00)
[3]鱼类营养免疫研究进展[J]. 艾庆辉,麦康森. 水生生物学报. 2007(03)
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[5]养殖大菱鲆腹水病病原的研究[J]. 李筠,颜显辉,陈吉祥,王印庚,李秋芬. 中国海洋大学学报(自然科学版). 2006(04)
[6]鱼类免疫机制及其影响因子[J]. 张艳秋,詹勇,许梓荣. 水产养殖. 2005(03)
[7]鲤鱼爱德华氏菌败血症的诊断和防治[J]. 张超睿,王可之,杨新山,高林. 内陆水产. 2002(08)
[8]海洋鱼病疫苗开发与生物反应器大规模生产[J]. 张元兴,马悦,孙修勤. 高技术通讯. 2000(02)
[9]鳗鲡爱德华菌病的诊断和病原学研究[J]. 薄清如,黄新民,郑帆,马珊珊,胡木枝,兰乃洪,黄建珍,廖春华,张远国. 中国兽医学报. 1999(03)
[10]迟缓爱德华氏菌的粘附特性[J]. 欧阳志明,陈怀青,陆承平. 南京农业大学学报. 1997(03)
博士论文
[1]迟钝爱德华氏菌双组分系统的毒力调控机制[D]. 吕远志.华东理工大学 2013
[2]迟钝爱德华氏菌双组份系统EsrA-EsrB和QseB-QseC的毒力调控机制[D]. 王鑫.华东理工大学 2011
[3]迟缓爱德华菌菌蜕疫苗的构建及动物免疫试验[D]. 王雪鹏.南京农业大学 2009
硕士论文
[1]杀鱼爱德华氏菌中Fur和EsrB对其生理和代谢的调控机制[D]. 赵路遥.华东理工大学 2017
[2]迟缓爱德华菌弱毒株的分离鉴定及对罗非鱼的免疫保护效果研究[D]. 庞晓茹.山东农业大学 2016
[3]迟钝爱德华氏菌活性氧抗性、双组分系统QseEF及三型分泌系统相关基因的功能鉴定[D]. 陈涛.华东理工大学 2011
本文编号：3367437
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