突变敏感性开关检测妊高压相关基因AGT多态性研究

发布时间：2021-08-31 20:52

　　目的:本文是研究用硫代磷酸酯修饰的碱基特异性引物结合高保真聚合酶所组成的突变敏感性分子"开/关"检测AGT基因T174M和M235T的热点突变。同时将该研究方法结合目前广泛应用于临床的荧光定量PCR技术,其特异性强,灵敏度高,全封闭等特点实现更理想分子诊断方法。方法:从数据库中分析AGT的SNP（single nucleotide polymophism,单核苷酸多态）结合文献中AGT高频突变位点T174M和M235T与妊娠高血压的相关性。从人血液基因组中扩增两个突变基因的DNA片段,将扩增产物与pMD19-T连接,转化至E.coliTOP10感受态细胞中,构建野生型载体质粒。用一种基因工程常用的细菌重组子的筛选方法筛选出正确克隆,用pMD19-T通用引物和DNA片段对应引物对挑选到的白色克隆用PCR方法鉴定,电泳结果中选出目标DNA经克隆测序以验证是否是目标克隆,确认AGT基因野生型模板。采用重叠延伸PCR技术,对基因多态分析位置的碱基用PCR单碱基突变,得到T174M和M235T两个多态位点基因型DNA片段,定向克隆方法后的产物同样用蓝白斑筛选技术选出目标条带,这些新构建的载体通过... 

【文章来源】：苏州大学江苏省 211工程院校

【文章页数】：45 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图１．?ＮＣＢＩ数据库中Ｔ１７４Ｍ基因多态性??

子水后揽拌溶解，将溶液定容至１?Ｌ后．窩温高压灭菌，室温保存。??）?ＩｘＴＡＥ缓冲液的配制：称量２０?ｍｌ的５０ＸＴＡＥ缓冲液巧加入９８０?ｍｌ的热点突变多态性分析??通过ＳＮＰｓ３ｄ，ＮＣＢＩ等在线工具对ＡＧＴ基因的两个突变基因Ｔ１７４Ｍ单核昔酸多态性分析，ＳＮＰ位点序号分别是（ｒｓ４７６２和ｒｓ６９９）如图１－２??？?Ｔ１７４Ｍ??１??線３Ｃ紀＾：ＣＯｅ坂Ｃ巧ＣＴＧＣＴｅ扣ＣＡ［Ｃ／７！献Ｔ说衍＾＾＾巧ｒｔＯ运滅ＣＣ口：：Ａ??３?２３Ｇ７１?始訂??貧馈ｅ?ＡＧＴ侣㈱护／齡！??Ｆｙｎｓｉｉｏｎ如?口ｉ?ｍｉｓｓｅｌｓ安??Ｖ鑛細＃ｄ?ｂｙ的５虹￥１赵■．麵的解＊儀风々Ｐ??獻含絲化ｌＡｆ?Ａ＝０?１６１敎如１９??ＨＳＶＳ?：拉。。’扣句１Ｄ空Ｓ３觀巧巧０式ｆ泣（Ｗ、颇１?１１＜ｉ之巧７１安玄３１这??：泌＿护姑身記１。皆！ｆ＇滅品ｔ顧召卽３?ｅ妓離ｆ■沁＊燃龄脚１审：踰裤Ｊ了段料??图１．?ＮＣＢＩ数据库中Ｔ１７４Ｍ基因多态性??Ｍ２３５Ｔ??

关键是重叠互补引物的设计厘叠延伸ＰＣＲ在基因的定点突变、融合基因的构建、长片??段基因的合成、基因敲除Ｗ及目的基因的扩増等方面有其广泛而独特的应用。??工作原理见图３：??１）上游（引物Ａ）与基因１号链起始密码子附近的序列相对应，并在５?＇末端添加??酶切位点和３个保护碱基；下游（Ｂ）与基因２号链突变点附近的序列，并去除１号??基因的单碱基，实现点突变。??巧上游（引物Ｃ）与基因２号链突变点附近的序列对应，实验点突变。基因１号??链起始密码子附近的序列相对应，并在５＇末端添加酶切位点和３个保护碱基；下游（Ｄ）??与基因２号链末端密码子附近的序列相对应，并在５味端添加酶切位点和３个保护碱??基。??３）分别用Ａ、Ｂ扩増出的片段ＡＢ，用Ｃ、Ｄ扩增出的片段ＣＤ，然后再用Ａ和Ｄ??将两基因连接起来

【参考文献】：
期刊论文
[1]血管紧张素系统相关基因多态性与妊娠期高血压疾病的相关性研究[J]. 江美琼,傅芬.  实用临床医学. 2008(05)
[2]胎儿血管紧张素转换酶基因多态性与妊高征发病的关系[J]. 朱铭伟,夏燕萍,程蔚蔚,翁慧钧,张振钧.  中华妇产科杂志. 1998(10)



本文编号：3375592