灰树花多糖合成途径中UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的基因结构与功能研究
发布时间：2021-09-06 11:14
灰树花（Grifola frondosa）作为食药兼用蕈菌,富含多糖、蛋白和微量元素等营养成分。研究表明,灰树花多糖,特别是葡聚糖,具有显著的抗肿瘤、免疫增强、降血糖等功能。本课题组前期已开展了灰树花多糖结构解析、功能评价及其合成途径等研究,推测灰树花葡聚糖合成主要依赖UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-glucose pyrophosphorylase of G.frondosa,GFUGP）合成UDP-葡萄糖,并由葡聚糖合成酶聚合而成。然而,有关GFUGP在灰树花菌体生长和多糖合成过程中的功能和作用的研究还未见报道。因此,在前期研究的基础上,本论文基于NCBI数据库公布的灰树花全基因组序列,克隆测序gfugp,并对其进行全面的生物信息学分析,并通过构建gfugp沉默菌株分析沉默gfugp对灰树花菌体形态、菌体/多糖产量、多糖组成及其合成途径中相关基因转录水平的影响,以期探明GFUGP在灰树花发酵过程中菌丝体生长和多糖合成中的主要功能。（1）灰树花UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因gfugp的克隆和生物信息学分析。克隆测序并重新注释了灰树花UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因gfugp,其gDNA全...
【文章来源】：江苏大学江苏省
【文章页数】：83 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
葡萄糖为底物的细菌EPS生物合成示意图
灰树花多糖合成途径中UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的基因结构与功能研究6变化。1.3.3UGP蛋白进化分析吴晓俊等[30]研究发现，大麦、马铃薯、拟南芥的UGP同源性85%，植物（大麦、马铃薯、拟南芥）与酵母菌、牛的UGP之间同源性约为55%；而与大肠杆菌UGP仅有18%的同源性。真核生物UGP较大，如大麦UGP含有473个氨基酸残基，酵母UGP中有699个氨基酸残基，而原核生物UGP较小，约有300个氨基酸残基。由图1.2可知，真核生物与原核生物UGP同源性很低，这说明真核生物UGP在进化早期就已经独立进化[31]。图1.2UGP及相关蛋白进化分支图（Kleczkowski.etal.2004）Figure1.2EvolutionbranchofUGPandrelatedproteins(Kleczkowski.etal.2004)1.3.4UGP亚细胞定位UGP广泛地存在于各个物种及其组织中。亚细胞定位表明细胞质、膜组分与微粒（高尔基体/叶绿体）等均含有UGP。RNA提取和免疫蛋白杂交实验的结果表明，ugp在马铃薯的块茎、地上茎、叶片等组织中均有表达，且UGP在生长中的块茎含量最高[32]。Kim等[33]发现，大米UGP大多数分布在细胞质，少量存在于高尔基体和造粉体等部位，Kimura等[34]利用免疫金标记也观察到大米类似的UGP分布情况。UGP的分布情况、基因表达水平与生物体生长代谢息息相关。比如，Riellahelicophylla根部从生长点至成熟区均存在UGP，并且伸长区和成熟区的UGP活性最高[35]。有研究报道，在拟南芥中UGP活性较高的是叶绿体[36]，大麦细胞则是细胞膜[37]。在细胞膜上存在高活性UGP，提示着
灰树花多糖合成途径中UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的基因结构与功能研究22葡萄糖焦磷酸化酶的基因序列。图2.1引物为gfugp-F、gfugp-R扩增产物凝胶电泳图Fig.2.1Electrophoresisofamplifiedproductsusedgfugp-Fandgfugp-Rprimers.M为DL5000marker，指示条带为1000bp；泳道1至3为利用引物gfUGP-F、gfUGP-R进行PCR反应后的产物凝胶电泳条带。图2.2扩增序列(3490bp)的启动子分析预测Figure2.2Promoteranalysispredictionofamplifiedfragment(3490bp)2.4.2灰树花gfugp生物信息学分析2.4.2.1灰树花gfugp基因内外显子分析通过FGENESH软件分析表明，灰树花UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因gfugp含有10个内含子及11个外显子（图2.3A），编码灰树花UDP-葡萄糖焦磷酸化酶GFUGP的cDNA序列全长为1392bp。2.4.2.2灰树花gfugp氨基酸序列与功能域分析DNAMAN软件预测gfugp编码的氨基酸序列（附录2）。Gfugp含有一个完整的开放阅读框（ORF），起始密码子为ATG，终止密码子为TGA；该基因的编码框（CDS）共编码463个氨基酸。分析GFUGP蛋白结构域，发现其具有一个UGPase特征功能域（图2.3B），位于氨基酸残基50~428，并且在氨基酸残基103~311具有16处底物结合位点。在线软件Phobius与SignalP4.0预测GFUGP无跨膜信号肽，GFUGP酶定位于
【参考文献】：
期刊论文
[1]α-PGM过表达对灵芝多糖发酵的影响[J]. 李瑞勤,王琼,沈梦烨,丁重阳,顾正华,张梁,石贵阳. 食品与生物技术学报. 2019(11)
[2]酵母UDP-葡萄糖合成途径的优化及黄酮葡萄糖苷的合成[J]. 王惠敏,杨燕,田雷瑜,周文龙,王伟. 中国医药生物技术. 2016(03)
[3]添加氧化铝对灰树花菌丝体生长及多糖产量的影响[J]. 陈潇筱,杨焱,崔凤杰,孙文敬,刘伟民. 食用菌学报. 2016(01)
[4]食用菌产业发展历史、现状与趋势[J]. 张金霞,陈强,黄晨阳,高巍,曲积彬. 菌物学报. 2015(04)
[5]灰树花及其药理作用研究进展[J]. 甘长飞. 食药用菌. 2014(05)
[6]PEG介导的猴头菌遗传转化体系的建立[J]. 刘莉,肖招燕,郭丽琼,林俊芳,尤琳烽,廖静文. 菌物学报. 2014(01)
[7]丝状真菌形态控制及其在发酵过程优化中的应用[J]. 熊强,徐晴,顾帅,李霜. 生物工程学报. 2012(02)
[8]灰树花多糖的提取及抗氧化活性[J]. 顾华杰,沈晨斌,严志舟,金琎,王桃云,胡翠英,陈家长. 生物加工过程. 2012(01)
[9]过量表达OsUgp2基因提高紫芝多糖含量[J]. 张帆,钟威,穆虹,李刚. 菌物学报. 2011(03)
[10]灵芝多糖的生物合成和发酵调控[J]. 刘高强,赵艳,王晓玲,朱朝阳. 菌物学报. 2011(02)
博士论文
[1]禾谷镰刀菌细胞壁形成相关基因及其 RNAi 片段功能鉴定[D]. 宋修仕.华中农业大学 2015
[2]灵芝碳代谢途径中UDP葡萄糖焦磷酸化酶和磷酸葡萄糖变位酶基因功能研究[D]. 李梦娇.南京农业大学 2015
[3]Paenibacillus elgii B69胞外多糖结构鉴定及生物合成途径研究[D]. 李欧.浙江大学 2014
[4]灵芝基因沉默体系的建立及NADPH氧化酶基因家族功能分析[D]. 穆大帅.南京农业大学 2013
硕士论文
[1]灰树花葡聚糖合成酶的基因结构和功能研究[D]. 陶庭磊.江苏大学 2019
[2]发酵环境影响灰树花菌丝体生长和多糖合成的研究[D]. 陈潇筱.江苏大学 2016
[3]灵芝菌丝体培养中多糖组分的变化与相关酶活性分析[D]. 王琼.江南大学 2013
本文编号：3387354
【文章来源】：江苏大学江苏省
【文章页数】：83 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
葡萄糖为底物的细菌EPS生物合成示意图
灰树花多糖合成途径中UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的基因结构与功能研究6变化。1.3.3UGP蛋白进化分析吴晓俊等[30]研究发现，大麦、马铃薯、拟南芥的UGP同源性85%，植物（大麦、马铃薯、拟南芥）与酵母菌、牛的UGP之间同源性约为55%；而与大肠杆菌UGP仅有18%的同源性。真核生物UGP较大，如大麦UGP含有473个氨基酸残基，酵母UGP中有699个氨基酸残基，而原核生物UGP较小，约有300个氨基酸残基。由图1.2可知，真核生物与原核生物UGP同源性很低，这说明真核生物UGP在进化早期就已经独立进化[31]。图1.2UGP及相关蛋白进化分支图（Kleczkowski.etal.2004）Figure1.2EvolutionbranchofUGPandrelatedproteins(Kleczkowski.etal.2004)1.3.4UGP亚细胞定位UGP广泛地存在于各个物种及其组织中。亚细胞定位表明细胞质、膜组分与微粒（高尔基体/叶绿体）等均含有UGP。RNA提取和免疫蛋白杂交实验的结果表明，ugp在马铃薯的块茎、地上茎、叶片等组织中均有表达，且UGP在生长中的块茎含量最高[32]。Kim等[33]发现，大米UGP大多数分布在细胞质，少量存在于高尔基体和造粉体等部位，Kimura等[34]利用免疫金标记也观察到大米类似的UGP分布情况。UGP的分布情况、基因表达水平与生物体生长代谢息息相关。比如，Riellahelicophylla根部从生长点至成熟区均存在UGP，并且伸长区和成熟区的UGP活性最高[35]。有研究报道，在拟南芥中UGP活性较高的是叶绿体[36]，大麦细胞则是细胞膜[37]。在细胞膜上存在高活性UGP，提示着
灰树花多糖合成途径中UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的基因结构与功能研究22葡萄糖焦磷酸化酶的基因序列。图2.1引物为gfugp-F、gfugp-R扩增产物凝胶电泳图Fig.2.1Electrophoresisofamplifiedproductsusedgfugp-Fandgfugp-Rprimers.M为DL5000marker，指示条带为1000bp；泳道1至3为利用引物gfUGP-F、gfUGP-R进行PCR反应后的产物凝胶电泳条带。图2.2扩增序列(3490bp)的启动子分析预测Figure2.2Promoteranalysispredictionofamplifiedfragment(3490bp)2.4.2灰树花gfugp生物信息学分析2.4.2.1灰树花gfugp基因内外显子分析通过FGENESH软件分析表明，灰树花UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因gfugp含有10个内含子及11个外显子（图2.3A），编码灰树花UDP-葡萄糖焦磷酸化酶GFUGP的cDNA序列全长为1392bp。2.4.2.2灰树花gfugp氨基酸序列与功能域分析DNAMAN软件预测gfugp编码的氨基酸序列（附录2）。Gfugp含有一个完整的开放阅读框（ORF），起始密码子为ATG，终止密码子为TGA；该基因的编码框（CDS）共编码463个氨基酸。分析GFUGP蛋白结构域，发现其具有一个UGPase特征功能域（图2.3B），位于氨基酸残基50~428，并且在氨基酸残基103~311具有16处底物结合位点。在线软件Phobius与SignalP4.0预测GFUGP无跨膜信号肽，GFUGP酶定位于
【参考文献】：
期刊论文
[1]α-PGM过表达对灵芝多糖发酵的影响[J]. 李瑞勤,王琼,沈梦烨,丁重阳,顾正华,张梁,石贵阳. 食品与生物技术学报. 2019(11)
[2]酵母UDP-葡萄糖合成途径的优化及黄酮葡萄糖苷的合成[J]. 王惠敏,杨燕,田雷瑜,周文龙,王伟. 中国医药生物技术. 2016(03)
[3]添加氧化铝对灰树花菌丝体生长及多糖产量的影响[J]. 陈潇筱,杨焱,崔凤杰,孙文敬,刘伟民. 食用菌学报. 2016(01)
[4]食用菌产业发展历史、现状与趋势[J]. 张金霞,陈强,黄晨阳,高巍,曲积彬. 菌物学报. 2015(04)
[5]灰树花及其药理作用研究进展[J]. 甘长飞. 食药用菌. 2014(05)
[6]PEG介导的猴头菌遗传转化体系的建立[J]. 刘莉,肖招燕,郭丽琼,林俊芳,尤琳烽,廖静文. 菌物学报. 2014(01)
[7]丝状真菌形态控制及其在发酵过程优化中的应用[J]. 熊强,徐晴,顾帅,李霜. 生物工程学报. 2012(02)
[8]灰树花多糖的提取及抗氧化活性[J]. 顾华杰,沈晨斌,严志舟,金琎,王桃云,胡翠英,陈家长. 生物加工过程. 2012(01)
[9]过量表达OsUgp2基因提高紫芝多糖含量[J]. 张帆,钟威,穆虹,李刚. 菌物学报. 2011(03)
[10]灵芝多糖的生物合成和发酵调控[J]. 刘高强,赵艳,王晓玲,朱朝阳. 菌物学报. 2011(02)
博士论文
[1]禾谷镰刀菌细胞壁形成相关基因及其 RNAi 片段功能鉴定[D]. 宋修仕.华中农业大学 2015
[2]灵芝碳代谢途径中UDP葡萄糖焦磷酸化酶和磷酸葡萄糖变位酶基因功能研究[D]. 李梦娇.南京农业大学 2015
[3]Paenibacillus elgii B69胞外多糖结构鉴定及生物合成途径研究[D]. 李欧.浙江大学 2014
[4]灵芝基因沉默体系的建立及NADPH氧化酶基因家族功能分析[D]. 穆大帅.南京农业大学 2013
硕士论文
[1]灰树花葡聚糖合成酶的基因结构和功能研究[D]. 陶庭磊.江苏大学 2019
[2]发酵环境影响灰树花菌丝体生长和多糖合成的研究[D]. 陈潇筱.江苏大学 2016
[3]灵芝菌丝体培养中多糖组分的变化与相关酶活性分析[D]. 王琼.江南大学 2013
本文编号：3387354
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