小麦基因编辑体系优化和几个内源基因的编辑及突变体创制

发布时间：2021-09-06 23:44

　　随着基因编辑技术的发展,规律间隔成簇短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeatsequences,CRISPR）结合Cas9蛋白系统已经在拟南芥、水稻和玉米等二倍体作物中得到了广泛应用。由于小麦是异源六倍体作物,基因组结构比较复杂,农杆菌介导CRISPR/SpCas9系统对小麦内源基因进行编辑的效率一直不高,特别是最新研发的CRISPR/LbCpf1和CRISPR/xCas9系统,在小麦中还未见相关报道,本研究拟利用之前研究中获得的无筛选标记材料H29,建立高效的小麦基因编辑系统,进而对小麦内源基因TaMTL、TaQ、TaWaxy和TaARG进行编辑,并对突变体进行表型鉴定和功能分析。主要研究结果如下:1.利用OsU6a、TaU3和TaU6启动子构建调控sgRNA表达的CRISPR/SpCas9载体,农杆菌介导对无筛选标记材料H29中的外源GUS基因进行编辑,发现TaU3调控sgRNA时的编辑效率最高（61.4%）。然后利用TaU3作为sgRNA的启动子,构建包含2个串联靶向外源GUS基因靶序列的编辑... 

【文章来源】：中国农业科学院北京市

【文章页数】：165 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑（DOUDNAetal.,2014）

中国农业科学院博士学位论文第一章绪论16体的诱导率，加速作物的育种进程；对TaQ基因发生编辑的突变体植株，研究其控制穗部形态的分子机制；对TaWaxy基因发生编辑的突变体植株，研究籽粒直链淀粉和支链淀粉含量对小麦品质的影响；对TaARG基因发生编辑的突变体植株，研究TaARG基因参与植物体内氮代谢过程的调控机制。研究结果为利用CRISPR编辑技术对小麦重要内源基因进行高效遗传修饰和在小麦中实现目标基因的定点插入等研究奠定基矗另外，本研究创制的突变体材料对于小麦单倍体育种、高产育种、品质育种和抗逆性改良等具有重要的应用价值。1.7技术路线本研究首先用实验室之前获得的无筛选标记转基因小麦株系H29（只含有外源GUS基因）为材料，比较CRISPR/SpCas9系统中不同sgRNA启动子OsU6a、TaU3和TaU6对外源GUS基因的编辑效率，筛选出sgRNA的最优启动子，然后在CRISPR/SpCas9、CRISPR/Cpf1和CRISPR/xCas9系统中利用优选的启动子构建2个靶向外源GUS基因的串联sgRNA，比较不同CRISPR系统的编辑效率。最后，利用优化的CRISPR/SpCas9系统编辑小麦内源基因TaMTL、TaQ、TaWaxy和TaARG，对编辑植株在分子生物学、细胞生物学、解刨学、农艺性状、品质性状和生物化学等层面上进行鉴定和研究，具体技术路线如图1-2所示。图1-2本研究技术路线图Fig.1-2Technologyroadmapofthisstudy

中国农业科学院博士学位论文第二章小麦农杆菌介导高效基因编辑体系建立18SYBRqPCRMasterMix购自南京诺唯赞科技有限公司。图2-1pWMB110载体结构图Fig.2-1StructureofexpressionvectorpWMB1102.1.3引物序列本研究所需的xCas9序列以及各种引物序列由生工生物工程上海股份有限公司合成，各种PCR扩增产物的测序由北京擎科生物科技有限公司完成。所需的引物序列见附录A。2.2实验方法2.2.1染色体原位杂交检测参照YUAN等（2015）的方法，具体步骤如下：1.将成熟种子浸泡后放于铺有滤纸的无菌水中，室温放置3-4d，待主根长度达2.5cm左右时，取长度约1cm根尖组织，放于离心管中，并在N2O中处理2h。2.用95%的冰醋酸固定根尖5min，吸出冰醋酸，用无菌水清洗2次。3.取出根尖用滤纸吸去水分，切取根尖生长点部位组织，放入由裂解酶、离析酶和果胶酶配置的裂解酶中，根据根尖情况在37℃水浴锅中裂解55-58min。


本文编号：3388417