体外穿孔素基因启动子低甲基化处理的CD4 + T淋巴细胞对自身免疫肺气肿大鼠肺泡隔细胞凋亡的影响
发布时间：2021-09-09 10:06
目的:有文献提示自身免疫肺气肿大鼠CD4+T淋巴细胞穿孔素基因启动子区域处于低甲基化状态同时伴有肺泡隔细胞凋亡,推测上述区域的低甲基化状态可能诱导自身免疫肺气肿大鼠肺泡隔细胞凋亡的形成。为探讨二者的关系,我们将体外穿孔素启动子区低甲基化处理的CD4+T淋巴细胞注射到正常大鼠腹腔中,观察其肺泡隔细胞凋亡及肺组织病理的改变,为进一步研究肺气肿的发病机制及寻找新的治疗方法提供思路。方法:将30只健康清洁级SD大鼠随机分为模型组、对照组、假手术组。模型组:分选出正常SD大鼠脾脏CD4+T淋巴细胞,加入含有甲基化抑制剂5-氮胞苷（5-Azacytidine,5-Aza）的细胞培养基中（5-Aza浓度:10μmol/l）孵育72小时,取1×107个细胞离心去上清,加完全弗氏佐剂1ml及磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline,PBS）1ml,腹腔注射其他正常SD大鼠1次,该组大鼠设为模型组,另取上述未打入大鼠体内的1×107个细胞检测上述区域甲基化水平,设为细胞组1...
【文章来源】：遵义医科大学贵州省
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【图文】：
VEGF阳性对照（IHC二步法,×400）
遵义医科大学硕士学位论文刘佳嘉14OD值。1.5.6免疫组化二步法测肺组织VEGF表达（1）肺组织病理切片放在60℃的温箱中2h使石蜡融化，经二甲苯及酒精脱水后予蒸馏水冲洗。（2）用柠檬酸抗原修复缓冲液进行标本抗原修复，加热8min后转小火7min，室温降温后予PBS清洗。（3）标本于3%H2O2常温下黑暗中静置25min后用PBS清洗；在组织表面滴加3%BSA封闭30min。（4）去除3%BSA后滴加VEGF一抗，4°C静置一夜。（5）PBS清洗切片，适当甩干切片后在组织表面滴加Peroxidase-ConjugatedGoatAnti-RabbitIgG二抗，常温下孵育50min。（6）PBS清洗切片后烘干标本片，添加二氨基联苯胺溶液（Diaminobenzidine，DAB），标本显色后予流动水冲洗。（7）苏木素复染，脱水封片。（8）光镜下镜检，采用双盲法采集图像进行分析。VEGF阳性表达呈棕黄色或棕褐色，定位在血管内皮细胞、支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞的胞浆内[28]，阳性对照（图1-1）光镜下可见细胞胞浆被染色，即为VEGF阳性表达，而阴性对照（图1-2，未加VEGF一抗）未见明显染色。参照文献方法，在高倍显微镜下（400倍），每张标本片随机选取3个视野，通过Imageproplus6.0得到每个视野中阳性蛋白的平均光密度值[29,30]。VEGF图1-1VEGF阳性对照（IHC二步法,×400）AVEGFVEGF图1-2VEGF阳性对照（IHC二步法,×400）
遵义医科大学硕士学位论文刘佳嘉161.5.8大鼠脾脏淋巴细胞分离（1）于超净工作台内进行无菌操作。（2）用无菌镊子及眼科剪清除脾脏表面的包膜等其他组织，PBS洗净后用眼科剪把脾脏剪至1mm3小块。（3）将所有脾脏转移到200目细胞筛内，筛下放置一无菌培养皿，用10ml注射器活塞小心研磨剪碎的脾脏组织，研磨过程中分次加入大鼠淋巴细胞分离液共5-6ml，使研磨分散下来的单细胞通过细胞筛进入培养皿，研磨5min。（2）把所有分离液转移到离心管内，轻轻覆盖1ml1640培养基，800g/min离心30min，离心后可见液体分为四层，从上至下第二层是淋巴细胞层，小心吸取该层细胞至15ml离心管，加入10ml1640培养液以300g/min离心10min。（5）弃掉上清后再次予PBS离心洗涤细胞计数。1.5.9磁珠分选大鼠脾脏CD4+T淋巴细胞（按Miltenyi说明书进行操作）（1）制备1×108～1×109/ml单细胞悬液，取100ul重悬于80ul的Buffer中，添加20ul磁珠，手动弹打以混合均匀标本，置于4℃冰箱15min。（2）加入2mlBuffer充分混合均匀，300g/min离心10min。（3）吸出上清液后加入500ulBuffer以重悬细胞。（4）摆好磁珠架和离心管的高度，固定LS阳性分选柱。（5）取3mlBuffer润洗LS柱，尽可能避免出现气泡。（6）Buffer快滴完时加样于分选柱中央，3mlBuffer清洗标本管后加入柱中，清洗3图1-3凋亡阳性对照光镜（×400）图1-4凋亡阴性对照光镜（×400）凋亡细胞凋亡细胞
【参考文献】：
期刊论文
[1]S100A8/RAGE、Caveolin-1在中性粒细胞性支气管哮喘大鼠中的作用及罗红霉素对其表达的影响[J]. 顾晓菲,陈鑫淼,陈慧君,徐挺挺,邱章伟,孙丹丹,葛翔挺,应颂敏,戴元荣. 中华结核和呼吸杂志. 2019(11)
[2]常用实验大小鼠采血方法及其对实验动物福利的影响[J]. 杨健莉,刘佳,郑志红. 中国比较医学杂志. 2019(01)
[3]不同麻醉剂及采血方式对SD大鼠和昆明小鼠血常规影响[J]. 郑杰蔚,陆丰荣,李国樑,谢植伟,钟怡洲,曾丽海,黄曼琪,张雅婷,殷霄,曾玉梨,高晨,张海燕,吴洁娇,江亮,黄振烈. 中国职业医学. 2018(01)
[4]血清白细胞介素、抗心磷脂抗体和抗血管内皮细胞抗体检测在川崎病患儿中的应用[J]. 孙晓晗,任立红,胡孟英,高慧,王志会. 中国医师进修杂志. 2017 (11)
[5]细胞凋亡和凋亡细胞清除与慢性阻塞性肺疾病[J]. 张凡,强丽霞,樊迪,张爽,金寿德. 临床肺科杂志. 2017(04)
[6]细胞凋亡发生机制研究进展[J]. 张梦颖,吕志跃,吴忠道. 热带医学杂志. 2016(10)
[7]VEGF在COPD发病机制中的研究进展[J]. 牛欢,丁毅鹏. 海南医学. 2015(08)
[8]甲泼尼龙琥珀酸钠对自身免疫性肺气肿大鼠肺泡隔细胞凋亡的影响[J]. 韩婧,张朝杰,张程,路苹,欧阳章宏,张湘燕. 中国生化药物杂志. 2014(04)
[9]甲基化抑制剂5-杂氮胞苷对T淋巴细胞株程序性死亡受体-1基因启动子区域甲基化水平及其表达的影响[J]. 张旻,肖新强,梁云生,彭敏源,蒋永芳,许允,龚国忠. 中南大学学报(医学版). 2011(12)
[10]5-杂氮胞苷对成人T淋巴细胞穿孔素基因启动子区域甲基化水平的影响[J]. 肖嵘,丁艳,陆前进,李亚萍,李勇坚,杨心洁,苏玉文,梁云生,张桂英,文海泉. 中南大学学报(医学版). 2006(06)
硕士论文
[1]SAM对自身免疫肺气肿大鼠CD4+T淋巴细胞穿孔素基因启动子甲基化状态及肺泡隔细胞凋亡的影响[D]. 李本雪.遵义医科大学 2019
[2]谷氨酰胺对急性缺氧所致肠黏膜损伤幼龄大鼠肠黏膜上皮细胞自噬影响研究[D]. 杜冬梅.西南医科大学 2019
本文编号：3391902
【文章来源】：遵义医科大学贵州省
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【图文】：
VEGF阳性对照（IHC二步法,×400）
遵义医科大学硕士学位论文刘佳嘉14OD值。1.5.6免疫组化二步法测肺组织VEGF表达（1）肺组织病理切片放在60℃的温箱中2h使石蜡融化，经二甲苯及酒精脱水后予蒸馏水冲洗。（2）用柠檬酸抗原修复缓冲液进行标本抗原修复，加热8min后转小火7min，室温降温后予PBS清洗。（3）标本于3%H2O2常温下黑暗中静置25min后用PBS清洗；在组织表面滴加3%BSA封闭30min。（4）去除3%BSA后滴加VEGF一抗，4°C静置一夜。（5）PBS清洗切片，适当甩干切片后在组织表面滴加Peroxidase-ConjugatedGoatAnti-RabbitIgG二抗，常温下孵育50min。（6）PBS清洗切片后烘干标本片，添加二氨基联苯胺溶液（Diaminobenzidine，DAB），标本显色后予流动水冲洗。（7）苏木素复染，脱水封片。（8）光镜下镜检，采用双盲法采集图像进行分析。VEGF阳性表达呈棕黄色或棕褐色，定位在血管内皮细胞、支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞的胞浆内[28]，阳性对照（图1-1）光镜下可见细胞胞浆被染色，即为VEGF阳性表达，而阴性对照（图1-2，未加VEGF一抗）未见明显染色。参照文献方法，在高倍显微镜下（400倍），每张标本片随机选取3个视野，通过Imageproplus6.0得到每个视野中阳性蛋白的平均光密度值[29,30]。VEGF图1-1VEGF阳性对照（IHC二步法,×400）AVEGFVEGF图1-2VEGF阳性对照（IHC二步法,×400）
遵义医科大学硕士学位论文刘佳嘉161.5.8大鼠脾脏淋巴细胞分离（1）于超净工作台内进行无菌操作。（2）用无菌镊子及眼科剪清除脾脏表面的包膜等其他组织，PBS洗净后用眼科剪把脾脏剪至1mm3小块。（3）将所有脾脏转移到200目细胞筛内，筛下放置一无菌培养皿，用10ml注射器活塞小心研磨剪碎的脾脏组织，研磨过程中分次加入大鼠淋巴细胞分离液共5-6ml，使研磨分散下来的单细胞通过细胞筛进入培养皿，研磨5min。（2）把所有分离液转移到离心管内，轻轻覆盖1ml1640培养基，800g/min离心30min，离心后可见液体分为四层，从上至下第二层是淋巴细胞层，小心吸取该层细胞至15ml离心管，加入10ml1640培养液以300g/min离心10min。（5）弃掉上清后再次予PBS离心洗涤细胞计数。1.5.9磁珠分选大鼠脾脏CD4+T淋巴细胞（按Miltenyi说明书进行操作）（1）制备1×108～1×109/ml单细胞悬液，取100ul重悬于80ul的Buffer中，添加20ul磁珠，手动弹打以混合均匀标本，置于4℃冰箱15min。（2）加入2mlBuffer充分混合均匀，300g/min离心10min。（3）吸出上清液后加入500ulBuffer以重悬细胞。（4）摆好磁珠架和离心管的高度，固定LS阳性分选柱。（5）取3mlBuffer润洗LS柱，尽可能避免出现气泡。（6）Buffer快滴完时加样于分选柱中央，3mlBuffer清洗标本管后加入柱中，清洗3图1-3凋亡阳性对照光镜（×400）图1-4凋亡阴性对照光镜（×400）凋亡细胞凋亡细胞
【参考文献】：
期刊论文
[1]S100A8/RAGE、Caveolin-1在中性粒细胞性支气管哮喘大鼠中的作用及罗红霉素对其表达的影响[J]. 顾晓菲,陈鑫淼,陈慧君,徐挺挺,邱章伟,孙丹丹,葛翔挺,应颂敏,戴元荣. 中华结核和呼吸杂志. 2019(11)
[2]常用实验大小鼠采血方法及其对实验动物福利的影响[J]. 杨健莉,刘佳,郑志红. 中国比较医学杂志. 2019(01)
[3]不同麻醉剂及采血方式对SD大鼠和昆明小鼠血常规影响[J]. 郑杰蔚,陆丰荣,李国樑,谢植伟,钟怡洲,曾丽海,黄曼琪,张雅婷,殷霄,曾玉梨,高晨,张海燕,吴洁娇,江亮,黄振烈. 中国职业医学. 2018(01)
[4]血清白细胞介素、抗心磷脂抗体和抗血管内皮细胞抗体检测在川崎病患儿中的应用[J]. 孙晓晗,任立红,胡孟英,高慧,王志会. 中国医师进修杂志. 2017 (11)
[5]细胞凋亡和凋亡细胞清除与慢性阻塞性肺疾病[J]. 张凡,强丽霞,樊迪,张爽,金寿德. 临床肺科杂志. 2017(04)
[6]细胞凋亡发生机制研究进展[J]. 张梦颖,吕志跃,吴忠道. 热带医学杂志. 2016(10)
[7]VEGF在COPD发病机制中的研究进展[J]. 牛欢,丁毅鹏. 海南医学. 2015(08)
[8]甲泼尼龙琥珀酸钠对自身免疫性肺气肿大鼠肺泡隔细胞凋亡的影响[J]. 韩婧,张朝杰,张程,路苹,欧阳章宏,张湘燕. 中国生化药物杂志. 2014(04)
[9]甲基化抑制剂5-杂氮胞苷对T淋巴细胞株程序性死亡受体-1基因启动子区域甲基化水平及其表达的影响[J]. 张旻,肖新强,梁云生,彭敏源,蒋永芳,许允,龚国忠. 中南大学学报(医学版). 2011(12)
[10]5-杂氮胞苷对成人T淋巴细胞穿孔素基因启动子区域甲基化水平的影响[J]. 肖嵘,丁艳,陆前进,李亚萍,李勇坚,杨心洁,苏玉文,梁云生,张桂英,文海泉. 中南大学学报(医学版). 2006(06)
硕士论文
[1]SAM对自身免疫肺气肿大鼠CD4+T淋巴细胞穿孔素基因启动子甲基化状态及肺泡隔细胞凋亡的影响[D]. 李本雪.遵义医科大学 2019
[2]谷氨酰胺对急性缺氧所致肠黏膜损伤幼龄大鼠肠黏膜上皮细胞自噬影响研究[D]. 杜冬梅.西南医科大学 2019
本文编号：3391902
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