陆地棉GhWRKY27/42/91基因的克隆和功能验证
发布时间：2021-09-11 12:12
棉花是中国重要的经济作物,在国民经济和社会发展中占有重要地位。早衰和非生物胁迫是限制棉花产量和品质的重要因素。WRKY转录因子在植物叶片衰老和非生物胁迫反应中发挥着重要的作用,但是参与调控棉花叶片衰老和非生物胁迫的WRKY转录因子知之甚少。前人对棉花WRKY转录因子进行了全基因组鉴定与分析,结合叶片衰老转录组和各种胁迫处理表达谱数据,筛选到在叶片衰老和非生物胁迫中上调表达的GhWRKY27/42/91基因。本研究旨在从棉花中克隆得到GhWRKY27/42/91基因并分析其功能,主要内容和结论如下:1.衰老上调表达的GhWRKY27基因的过表达转基因拟南芥衰老提前,叶绿素含量降低,衰老相关基因表达升高。转录激活试验表明GhWRKY27没有自激活活性。酵母双杂交文库筛选到67个GhWRKY27的潜在互作蛋白,酵母双杂交和双分子荧光互补试验表明GhWRKY27与潜在互作蛋白MYB转录因子GhTT2相互作用。酵母单杂交和凝胶阻滞电泳结果显示GhWRKY27可以直接结合细胞色素P450 94C1（GhCYP94C1）和成熟相关蛋白2（GhRipen2-2）的启动子并在双荧光素酶报告系统中激活它们...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：125 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
陆生植物基因家族分类(Chenetal.,2018)
与 pGBKT7-GhWRKY27 质粒共同转到酵母感受态细胞 Y2HGold 中，转化产物涂布在 SD-TL平板上 30℃恒温培养箱倒置培养 3-5 天（如前 2.1.8.6 所述）。然后挑取单克隆，稀释后点在 SD-TL和 SD-TLHA/X/AbA 的培养平板上。质粒 pGADT7-largeT 和 pGBKT7-p53 共转的酵母作为阳性对照，pGADT7-largeT 和 pGBKT7-laminC 共转的酵母作为阴性对照。候选基因构建载体的引物序列如下（上下游引物的选取的酶切位点均分别为 EcoRⅠ和 BamHⅠ）：GhBTF3-F：5′-GGAGGCCAGTGAATTCATGAACAAGGAGAGGCT-3′（Gh_A08G2018）GhBTF3-R：5′-CGAGCTCGATGGATCCCTATTTAGCAGCTTGGCC-3′GhTT2-F：5′-GGAGGCCAGTGAATTCATGGGGAGGAGGCCTT-3′（Gh_A07G0140）GhTT2-R：5′-CGAGCTCGATGGATCCTTAGTTGATCCATTCATCTTCA-3′GhRD21A-F：5′-GGAGGCCAGTGAATTCATGGGTTCTCAGGGATC-3′（Gh_D01G1044）GhRD21A-R：5′-CGAGCTCGATGGATCCTCAATGTGCCCAGAACG-3′2.1.10 双分子荧光互补（BiFC）2.1.10.1 载体的构建PCR 扩增 GhWRKY27 以及三个候选基因 BTF3、RD21A 和 TT2 的 cDNA 全长序列，选择合适的酶切位点，分别构建到表达载体 pUC-SPYNE 和 pUC-SPYCE 上，载体信息如图 2.1。
图 2.2 pGreenII 62-SK 和 pGreenII 0800-LUC 载体信息(Hellens et al., 2005)Figure 2.2 The information of pGreenII 62-SK and pGreenII 0800-LUC vectors (Hellens et al., 2005)2.1.13.2 载体的构建克隆 GhWRKY27 转录因子的 cDNA 序列，构建到 effector 载体 pGreenII 62-SK 上，所用引物为（上下游引物酶切位点分别为 BamHⅠ和 XhoⅠ）：SK-WRKY27-F：5′-AGAACTAGTGGATCCATGGAGAACATGTGGAAGTG-3′SK-WRKY27-R：5′-GGGCCCCCCCTCGAGTTAGGAGAAAAATCCCGGTG-3′SK-TT2-F：5′-AGAACTAGTGGATCCATGGGGAGGAGGCCTTGCTGT-3′SK-TT2-R：5′-GGGCCCCCCCTCGAGTTAGTTGATCCATTCATCTTCA-3′克隆 GhCYP94C1 和 GhRipen2-2 的启动子序列至 reporter 载体 pGreenII 0800-LUC 上，所用引物为（上下游引物酶切位点分别为 XhoⅠ和 BamHⅠ）：LUC-CYP94C1-F：5′-GGGCCCCCCCTCGAGACTACCCAATACTCAGTAGATC-3′LUC-CYP94C1-R：5′-AGAACTAGTGGATCCTTTGATTGATGGAAAGAAAATAAG-3′LUC-Ripen2-2-F：5′-GGGCCCCCCCTCGAGGGACCAAATAAAAATGCTAAAAC-3′LUC-Ripen2-2-R：5′-AGAACTAGTGGATCCCTTGAATTTCTTTTGTTAAATCTTT-3′将扩增片段胶回收（如前 2.1.7.2 所述），回收产物构建分别连接到相应的载体上（如前 2.1.7.3所述）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]棉花WRKY22基因分离及其对黄萎病的抗性分析[J]. 雷煜,张振楠,胡广,刘建芬,唐叶,张宁,司怀军,吴家和. 华北农学报. 2018(06)
[2]盐胁迫下陆地棉耐盐相关WRKY基因的表达分析[J]. 蔡继鸿,徐鹏,张香桂,郭琪,徐珍珍,沈新莲. 江苏农业科学. 2018(18)
[3]海岛棉GbWRKY53基因的克隆与表达分析[J]. 李静,刘思敏,蔡丽静,王昭玉,董丽君,刘建凤,张书玲. 中国农业科技导报. 2017(11)
[4]陆地棉基因GhWRKY40-1的克隆及表达分析[J]. 司爱君,田琴,陈红,余渝. 棉花学报. 2017(02)
[5]陆地棉盐胁迫应答基因GhWRKY41的克隆与分析[J]. 苏莹,甄军波,张曦,王玉美,李乐,华金平. 中国农业大学学报. 2016(12)
[6]番茄WRKY基因家族的生物信息学分析[J]. 张红,姜景彬,许向阳,李景富. 分子植物育种. 2016(08)
[7]棉花转录因子GhWRKY11的克隆及功能分析[J]. 窦玲玲,李光雷,庞朝友,魏恒玲,范术丽,宋美珍,喻树迅. 农业生物技术学报. 2016(05)
[8]GhWRKY44基因在烟草中遗传转化及功能分析[J]. 赵曾强,韩泽刚,李会会,李潇玲,张析,张薇. 华北农学报. 2016(01)
[9]桃WRKY基因家族全基因组鉴定和表达分析[J]. 谷彦冰,冀志蕊,迟福梅,乔壮,徐成楠,张俊祥,周宗山,董庆龙. 遗传. 2016(03)
[10]棉花GhWRKY106-1的克隆与表达分析[J]. 李会会,赵曾强,韩泽刚,张析,李潇玲,张薇. 分子植物育种. 2015(11)
博士论文
[1]棉花衰老相关WRKY基因的克隆与功能分析[D]. 窦玲玲.西北农林科技大学 2016
硕士论文
[1]棉花WRKY转录因子家族基因鉴定、表达分析和WRKY46功能研究[D]. 戴鹤.河北农业大学 2015
[2]陆地棉抗旱相关基因（GhTrx、GhGR）克隆及其功能分析[D]. 宋贵方.河南大学 2012
本文编号：3392977
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：125 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
陆生植物基因家族分类(Chenetal.,2018)
与 pGBKT7-GhWRKY27 质粒共同转到酵母感受态细胞 Y2HGold 中，转化产物涂布在 SD-TL平板上 30℃恒温培养箱倒置培养 3-5 天（如前 2.1.8.6 所述）。然后挑取单克隆，稀释后点在 SD-TL和 SD-TLHA/X/AbA 的培养平板上。质粒 pGADT7-largeT 和 pGBKT7-p53 共转的酵母作为阳性对照，pGADT7-largeT 和 pGBKT7-laminC 共转的酵母作为阴性对照。候选基因构建载体的引物序列如下（上下游引物的选取的酶切位点均分别为 EcoRⅠ和 BamHⅠ）：GhBTF3-F：5′-GGAGGCCAGTGAATTCATGAACAAGGAGAGGCT-3′（Gh_A08G2018）GhBTF3-R：5′-CGAGCTCGATGGATCCCTATTTAGCAGCTTGGCC-3′GhTT2-F：5′-GGAGGCCAGTGAATTCATGGGGAGGAGGCCTT-3′（Gh_A07G0140）GhTT2-R：5′-CGAGCTCGATGGATCCTTAGTTGATCCATTCATCTTCA-3′GhRD21A-F：5′-GGAGGCCAGTGAATTCATGGGTTCTCAGGGATC-3′（Gh_D01G1044）GhRD21A-R：5′-CGAGCTCGATGGATCCTCAATGTGCCCAGAACG-3′2.1.10 双分子荧光互补（BiFC）2.1.10.1 载体的构建PCR 扩增 GhWRKY27 以及三个候选基因 BTF3、RD21A 和 TT2 的 cDNA 全长序列，选择合适的酶切位点，分别构建到表达载体 pUC-SPYNE 和 pUC-SPYCE 上，载体信息如图 2.1。
图 2.2 pGreenII 62-SK 和 pGreenII 0800-LUC 载体信息(Hellens et al., 2005)Figure 2.2 The information of pGreenII 62-SK and pGreenII 0800-LUC vectors (Hellens et al., 2005)2.1.13.2 载体的构建克隆 GhWRKY27 转录因子的 cDNA 序列，构建到 effector 载体 pGreenII 62-SK 上，所用引物为（上下游引物酶切位点分别为 BamHⅠ和 XhoⅠ）：SK-WRKY27-F：5′-AGAACTAGTGGATCCATGGAGAACATGTGGAAGTG-3′SK-WRKY27-R：5′-GGGCCCCCCCTCGAGTTAGGAGAAAAATCCCGGTG-3′SK-TT2-F：5′-AGAACTAGTGGATCCATGGGGAGGAGGCCTTGCTGT-3′SK-TT2-R：5′-GGGCCCCCCCTCGAGTTAGTTGATCCATTCATCTTCA-3′克隆 GhCYP94C1 和 GhRipen2-2 的启动子序列至 reporter 载体 pGreenII 0800-LUC 上，所用引物为（上下游引物酶切位点分别为 XhoⅠ和 BamHⅠ）：LUC-CYP94C1-F：5′-GGGCCCCCCCTCGAGACTACCCAATACTCAGTAGATC-3′LUC-CYP94C1-R：5′-AGAACTAGTGGATCCTTTGATTGATGGAAAGAAAATAAG-3′LUC-Ripen2-2-F：5′-GGGCCCCCCCTCGAGGGACCAAATAAAAATGCTAAAAC-3′LUC-Ripen2-2-R：5′-AGAACTAGTGGATCCCTTGAATTTCTTTTGTTAAATCTTT-3′将扩增片段胶回收（如前 2.1.7.2 所述），回收产物构建分别连接到相应的载体上（如前 2.1.7.3所述）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]棉花WRKY22基因分离及其对黄萎病的抗性分析[J]. 雷煜,张振楠,胡广,刘建芬,唐叶,张宁,司怀军,吴家和. 华北农学报. 2018(06)
[2]盐胁迫下陆地棉耐盐相关WRKY基因的表达分析[J]. 蔡继鸿,徐鹏,张香桂,郭琪,徐珍珍,沈新莲. 江苏农业科学. 2018(18)
[3]海岛棉GbWRKY53基因的克隆与表达分析[J]. 李静,刘思敏,蔡丽静,王昭玉,董丽君,刘建凤,张书玲. 中国农业科技导报. 2017(11)
[4]陆地棉基因GhWRKY40-1的克隆及表达分析[J]. 司爱君,田琴,陈红,余渝. 棉花学报. 2017(02)
[5]陆地棉盐胁迫应答基因GhWRKY41的克隆与分析[J]. 苏莹,甄军波,张曦,王玉美,李乐,华金平. 中国农业大学学报. 2016(12)
[6]番茄WRKY基因家族的生物信息学分析[J]. 张红,姜景彬,许向阳,李景富. 分子植物育种. 2016(08)
[7]棉花转录因子GhWRKY11的克隆及功能分析[J]. 窦玲玲,李光雷,庞朝友,魏恒玲,范术丽,宋美珍,喻树迅. 农业生物技术学报. 2016(05)
[8]GhWRKY44基因在烟草中遗传转化及功能分析[J]. 赵曾强,韩泽刚,李会会,李潇玲,张析,张薇. 华北农学报. 2016(01)
[9]桃WRKY基因家族全基因组鉴定和表达分析[J]. 谷彦冰,冀志蕊,迟福梅,乔壮,徐成楠,张俊祥,周宗山,董庆龙. 遗传. 2016(03)
[10]棉花GhWRKY106-1的克隆与表达分析[J]. 李会会,赵曾强,韩泽刚,张析,李潇玲,张薇. 分子植物育种. 2015(11)
博士论文
[1]棉花衰老相关WRKY基因的克隆与功能分析[D]. 窦玲玲.西北农林科技大学 2016
硕士论文
[1]棉花WRKY转录因子家族基因鉴定、表达分析和WRKY46功能研究[D]. 戴鹤.河北农业大学 2015
[2]陆地棉抗旱相关基因（GhTrx、GhGR）克隆及其功能分析[D]. 宋贵方.河南大学 2012
本文编号：3392977
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