羊源类鼻疽伯克霍尔德菌BPSS1512基因克
发布时间：2021-09-23 06:01
为克隆羊源类鼻疽伯克霍尔德菌BPSS1512基因,并对其编码的蛋白进行生物信息学分析,以类鼻疽伯克霍尔德菌基因组为模板,参照GenBank中Burkholderia pseudomallei K96243株基因组DNA序列（登录号:NC006351.1）设计引物,PCR扩增BPSS1512基因,构建重组质粒,SDS-PAGE和Western blotting分析其蛋白表达,DNAMAN等软件对BPSS1512基因编码的氨基酸序列进行分析。结果显示,PCR扩增成功得到1 425bp的特异性条带,BamHⅠ和HindⅢ双酶切后得到约为5 000和1 500bp的条带,表明重组质粒pET-28a-BPSS1512构建成功,IPTG浓度为10mmol/L,诱导时间8h为最适宜的诱导条件。BPSS1512基因编码的蛋白质分子质量为53ku,在包涵体中表达;在BPSS1512蛋白二级结构中,α-螺旋、延伸链和无规卷曲分别占24.05%、14.77%、61.18%,并且疏水性区域分布在-2.0+2.4之间,说明BPSS1512蛋白具有较强的疏水性,本试验结...
【文章来源】：中国畜牧兽医. 2017,44(08)北大核心
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
图１ＢＰＳＳ１５１２基因ＰＣＲ产物凝胶电泳检测Ｆｉｇ．１ＧｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆＢＰＳＳ１５１２ｇｅｎｅＰＣＲｐｒｏｄｕｃ－
８期曹瑞勇等：羊源类鼻疽伯克霍尔德菌ＢＰＳＳ１５１２基因克垄原核表达及其蛋白的生物信息学分析２．６．２ＢＰＳＳ１５１２蛋白疏水性分析用ＢｉｏＥｄｉｔ软件对目的基因编码的氨基酸序列进行Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ平均疏水性轮廓分析。曲线的分值越低，其亲水性越高，ＢＰＳＳ１５１２蛋白大部分疏水性区域分布在－２．０～＋２．４范围之间（图８），说明了ＢＰＳＳ１５１２蛋白具有较强的疏水性。图８ＢＰＳＳ１５１２蛋白疏水性分析Ｆｉｇ．８ＨｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆＢＰＳＳ１５１２ｐｒｏｔｅｉｎ３讨论类鼻疽病临床表现多样，在微生物诊断条件有限的地区确诊极其困难，死亡率较高，具有广谱耐药、复发率高等特点［１４－１５］，广泛流行于非洲东南部和澳大利亚北部，其病原菌可通过多种途径感染人和动物。类鼻疽病病原菌———类鼻疽伯克霍尔德菌已被美国ＣＤＣ列为Ⅰ类病原菌。有调查表明，５０％的类鼻疽伯克霍尔德菌感染者本身患有糖尿病，并且被感染者经常发生败血性休克和肺炎［１５］，由于其病原菌固有的抗药性使抗生素治疗效果不佳，目前尚无有效的疫苗预防此病［１６］。中国海南是类鼻疽病的高发地区，加强类鼻疽病防制对其公共卫生安全具有重大意义［１７－１９］。ＢＰＳＳ１５１２基因编码的类鼻疽伯克霍尔德菌泛酸蛋白酵素ＴｓｓＭ在宿主细胞内分泌，可以抑制宿主的先天免疫应答［１９］。与该基因相连的Ｔ６ＳＳ基因簇是ＶｉｒＡＧ毒力调节子的一部分，编码的蛋白包含一个泛素特异性的蛋白酶结构域（肽酶Ｃ１９Ｅ家族），其进入宿主细胞后可能干扰泛素蛋白降
构预测；用ＢｉｏＥｄｉｔ软件进行Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ平均疏水性轮廓分析。２结果２．１ＰＣＲ扩增与克隆以类鼻疽伯克霍尔德菌基因组为模板进行ＰＣＲ反应，对扩增产物进行１．０％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，ＰＣＲ扩增得到１４２５ｂｐ的特异性条带（图１），与目的条带大小相符。测序结果显示，该片段与ＧｅｎＢａｎｋ中收录的Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｐｓｅｕｄ－ｏｍａｌｌｅｉＫ９６２４３株基因组ＢＰＳＳ１５１２基因序列同源性为９９％。图１ＢＰＳＳ１５１２基因ＰＣＲ产物凝胶电泳检测Ｆｉｇ．１ＧｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆＢＰＳＳ１５１２ｇｅｎｅＰＣＲｐｒｏｄｕｃ－ｔｉｏｎ２．２酶切鉴定ｐＥＴ－２８ａ－ＢＰＳＳ１５１２重组质粒将构建成功的重组质粒ｐＥＴ－２８ａ－ＢＰＳＳ１５１２转化Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）感受态细胞，扩大培养后提取质粒，用ＢａｍＨⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切，得到约为５０００和１５００ｂｐ的条带（图２）。经测序证明ＢＰＳＳ１５１２基因已被成功连接到ｐＥＴ－２８ａ质粒中，即ｐＥＴ－２８ａ－ＢＰＳＳ１５１２重组质粒构建成功。２．３ｐＥＴ－２８ａ－ＢＰＳＳ１５１２的诱导表达重组质粒ｐＥＴ－２８ａ－ＢＰＳＳ１５１２分别用０．００１、０．０１、０．１、１、１０ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ３７℃诱导６ｈ，经１２．０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测发现，重组蛋白表达量２２３６
【参考文献】：
期刊论文
[1]海南类鼻疽临床流行病学研究报告[J]. 赵梅,陈妮,陈如寿,林翀. 实用药物与临床. 2016(07)
[2]羊种布鲁氏菌Omp10基因的克隆及原核表达[J]. 徐开莲,朱华培,赵天靖,贾晓晓,郭莳雨,庞峰,焦寒伟,成鹰,杜丽,史巧芸,荣辉,张珈宁,王凤阳. 中国畜牧兽医. 2014(12)
[3]布鲁氏菌外膜蛋白2b基因的克隆、原核表达及蛋白生物信息学分析[J]. 赵天靖,贾晓晓,焦寒伟,朱华培,徐开莲,郭莳雨,史巧芸,荣辉,成鹰,张珈宁,庞峰,杜丽,王凤阳. 中国畜牧兽医. 2014(09)
[4]海南岛类鼻疽40例患者的临床特征及随访分析[J]. 钟有清,林慧. 中华肺部疾病杂志(电子版). 2014(02)
[5]细菌Ⅵ型分泌系统结构与调控的研究进展[J]. 姚丰华,张钰,朱国强. 中国动物传染病学报. 2013(06)
[6]羊布鲁菌外膜蛋白Bp-26基因的克隆及其原核表达[J]. 史巧芸,荣辉,郭莳雨,贾晓晓,张珈宁,朱华培,杜丽,成鹰,焦寒伟,王凤阳. 动物医学进展. 2013(09)
[7]加强类鼻疽的研究[J]. 毛旭虎. 第三军医大学学报. 2011(13)
[8]今日中国包虫病地区分布(英文)[J]. 蒋次鹏. Chinese Medical Journal. 2002(08)
博士论文
[1]miRNAs介导的自噬抑制在类鼻疽杆菌感染免疫逃逸中的作用机制研究[D]. 李倩.第三军医大学 2015
[2]副溶血弧菌VI型分泌系统功能及其调控[D]. 俞盈.浙江大学 2012
本文编号：3405170
【文章来源】：中国畜牧兽医. 2017,44(08)北大核心
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
图１ＢＰＳＳ１５１２基因ＰＣＲ产物凝胶电泳检测Ｆｉｇ．１ＧｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆＢＰＳＳ１５１２ｇｅｎｅＰＣＲｐｒｏｄｕｃ－
８期曹瑞勇等：羊源类鼻疽伯克霍尔德菌ＢＰＳＳ１５１２基因克垄原核表达及其蛋白的生物信息学分析２．６．２ＢＰＳＳ１５１２蛋白疏水性分析用ＢｉｏＥｄｉｔ软件对目的基因编码的氨基酸序列进行Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ平均疏水性轮廓分析。曲线的分值越低，其亲水性越高，ＢＰＳＳ１５１２蛋白大部分疏水性区域分布在－２．０～＋２．４范围之间（图８），说明了ＢＰＳＳ１５１２蛋白具有较强的疏水性。图８ＢＰＳＳ１５１２蛋白疏水性分析Ｆｉｇ．８ＨｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆＢＰＳＳ１５１２ｐｒｏｔｅｉｎ３讨论类鼻疽病临床表现多样，在微生物诊断条件有限的地区确诊极其困难，死亡率较高，具有广谱耐药、复发率高等特点［１４－１５］，广泛流行于非洲东南部和澳大利亚北部，其病原菌可通过多种途径感染人和动物。类鼻疽病病原菌———类鼻疽伯克霍尔德菌已被美国ＣＤＣ列为Ⅰ类病原菌。有调查表明，５０％的类鼻疽伯克霍尔德菌感染者本身患有糖尿病，并且被感染者经常发生败血性休克和肺炎［１５］，由于其病原菌固有的抗药性使抗生素治疗效果不佳，目前尚无有效的疫苗预防此病［１６］。中国海南是类鼻疽病的高发地区，加强类鼻疽病防制对其公共卫生安全具有重大意义［１７－１９］。ＢＰＳＳ１５１２基因编码的类鼻疽伯克霍尔德菌泛酸蛋白酵素ＴｓｓＭ在宿主细胞内分泌，可以抑制宿主的先天免疫应答［１９］。与该基因相连的Ｔ６ＳＳ基因簇是ＶｉｒＡＧ毒力调节子的一部分，编码的蛋白包含一个泛素特异性的蛋白酶结构域（肽酶Ｃ１９Ｅ家族），其进入宿主细胞后可能干扰泛素蛋白降
构预测；用ＢｉｏＥｄｉｔ软件进行Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ平均疏水性轮廓分析。２结果２．１ＰＣＲ扩增与克隆以类鼻疽伯克霍尔德菌基因组为模板进行ＰＣＲ反应，对扩增产物进行１．０％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，ＰＣＲ扩增得到１４２５ｂｐ的特异性条带（图１），与目的条带大小相符。测序结果显示，该片段与ＧｅｎＢａｎｋ中收录的Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｐｓｅｕｄ－ｏｍａｌｌｅｉＫ９６２４３株基因组ＢＰＳＳ１５１２基因序列同源性为９９％。图１ＢＰＳＳ１５１２基因ＰＣＲ产物凝胶电泳检测Ｆｉｇ．１ＧｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆＢＰＳＳ１５１２ｇｅｎｅＰＣＲｐｒｏｄｕｃ－ｔｉｏｎ２．２酶切鉴定ｐＥＴ－２８ａ－ＢＰＳＳ１５１２重组质粒将构建成功的重组质粒ｐＥＴ－２８ａ－ＢＰＳＳ１５１２转化Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）感受态细胞，扩大培养后提取质粒，用ＢａｍＨⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切，得到约为５０００和１５００ｂｐ的条带（图２）。经测序证明ＢＰＳＳ１５１２基因已被成功连接到ｐＥＴ－２８ａ质粒中，即ｐＥＴ－２８ａ－ＢＰＳＳ１５１２重组质粒构建成功。２．３ｐＥＴ－２８ａ－ＢＰＳＳ１５１２的诱导表达重组质粒ｐＥＴ－２８ａ－ＢＰＳＳ１５１２分别用０．００１、０．０１、０．１、１、１０ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ３７℃诱导６ｈ，经１２．０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测发现，重组蛋白表达量２２３６
【参考文献】：
期刊论文
[1]海南类鼻疽临床流行病学研究报告[J]. 赵梅,陈妮,陈如寿,林翀. 实用药物与临床. 2016(07)
[2]羊种布鲁氏菌Omp10基因的克隆及原核表达[J]. 徐开莲,朱华培,赵天靖,贾晓晓,郭莳雨,庞峰,焦寒伟,成鹰,杜丽,史巧芸,荣辉,张珈宁,王凤阳. 中国畜牧兽医. 2014(12)
[3]布鲁氏菌外膜蛋白2b基因的克隆、原核表达及蛋白生物信息学分析[J]. 赵天靖,贾晓晓,焦寒伟,朱华培,徐开莲,郭莳雨,史巧芸,荣辉,成鹰,张珈宁,庞峰,杜丽,王凤阳. 中国畜牧兽医. 2014(09)
[4]海南岛类鼻疽40例患者的临床特征及随访分析[J]. 钟有清,林慧. 中华肺部疾病杂志(电子版). 2014(02)
[5]细菌Ⅵ型分泌系统结构与调控的研究进展[J]. 姚丰华,张钰,朱国强. 中国动物传染病学报. 2013(06)
[6]羊布鲁菌外膜蛋白Bp-26基因的克隆及其原核表达[J]. 史巧芸,荣辉,郭莳雨,贾晓晓,张珈宁,朱华培,杜丽,成鹰,焦寒伟,王凤阳. 动物医学进展. 2013(09)
[7]加强类鼻疽的研究[J]. 毛旭虎. 第三军医大学学报. 2011(13)
[8]今日中国包虫病地区分布(英文)[J]. 蒋次鹏. Chinese Medical Journal. 2002(08)
博士论文
[1]miRNAs介导的自噬抑制在类鼻疽杆菌感染免疫逃逸中的作用机制研究[D]. 李倩.第三军医大学 2015
[2]副溶血弧菌VI型分泌系统功能及其调控[D]. 俞盈.浙江大学 2012
本文编号：3405170
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