利用CRISPR/Cas9技术敲除小鼠ES细胞H2-K1基因

发布时间：2021-09-28 12:40

　　利用CRISPR/Cas9和ES细胞技术,在小鼠ES细胞株上敲除小鼠H2-K1基因,为研发MHCⅠ类基因人源化小鼠打下基础。设计了两个单向导RNA（single guide RNA,sgRNA）,分别靶向H2-K1基因的外显子2和外显子3。以p X330质粒为骨架构建表达sgRNA的打靶载体。用电穿孔转染法将构建好的质粒以及p SUPER-puro共同导入小鼠ES细胞中,实现基因敲除。在嘌呤霉素筛选后,利用PCR初步检测靶基因的敲除情况,再通过测序以及流式细胞分析确定敲除H2-K1基因的小鼠ES细胞。结果显示:利用CRISPR/Cas9技术,小鼠ES细胞的H2-K1基因被成功敲除,通过PCR检测到4个克隆为H2-K1单等位基因敲除（19.0%）,2个克隆为H2-K1双等位基因敲除（9.5%）。经过测序以及流式细胞分析,2株小鼠ES细胞被确认为H2-K1双等位基因敲除。本研究利用CRISPR/Cas9技术得到H2-K1基因敲除的小鼠ES细胞株,为MHCⅠ类基因的敲除和置换提供了参考。 

【文章来源】：中山大学学报(自然科学版). 2017,56(02)北大核心CSCD

【文章页数】：8 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 细胞株、质粒和主要试剂
    1.2 sgRNA靶点的选择及其序列的合成
    1.3 质粒构建
    1.4 细胞培养、转染和药筛
    1.5 m ES细胞克隆的扩增和基因组DNA的提取
    1.6 m ES细胞基因打靶的鉴定
    1.7 基因打靶细胞表型鉴定
2 结果
    2.1 CRSPR/Cas9基因打靶载体的设计与构建
    2.2 小鼠ES细胞H2-K1基因打靶
    2.3 m ES细胞克隆基因型鉴定
    2.4 H2-K1基因表达的鉴定
3 讨论


【参考文献】：
期刊论文
[1]供体同源臂长度对ZFN介导的同源重组效率的影响[J]. 聂宇,乔艳乐,陈瑶生,何祖勇.  中山大学学报(自然科学版). 2016(04)
[2]DNA剪刀——TALEN和CRISPR/Cas[J]. 倪培凌,刘畅,陈凌懿.  中国细胞生物学学报. 2014(01)



本文编号：3411915