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髓系肿瘤中DNMT3A基因内甲基化态势的临床研究

发布时间：2017-05-02 16:11

  本文关键词：髓系肿瘤中DNMT3A基因内甲基化态势的临床研究，由笔耕文化传播整理发布。


【摘要】：目的检测急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)、慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia,CML)和骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)患者及健康对照组标本中DNA甲基转移酶3A基因(DNMT3A)基因内差异性甲基化区域2(DMR2)甲基化态势,并统计分析其临床意义。方法应用实时定量PCR(real-time quantitative PCR,RQ-PCR)技术检测56例AML患者及18例对照组中DNMT3A四种异构体的表达,应用定量甲基化特异性PCR(real-time quantitative methylation-specific PCR,RQ-MSP)技术检测152例AML、82例CML、90例MDS及18例健康对照组中骨髓单个核细胞的DNMT3A DMR2甲基化状态,应用亚硫酸氢盐测序(bisulfite sequencing PCR,PCR)技术分析DNMT3A DMR2区域的甲基化密度。结果AML、CML和MDS患者较对照组中均存在不同程度的DNMT3A DMR2低甲基化。(1)AML中DNMT3A DMR2甲基化152例AML患者中,84例(55%)为DNMT3A DMR2低甲基化。随机挑选的两例高甲基化患者BSP测序结果示甲基化密度为72.41%和93.97%,两例低甲基化患者甲基化密度为1.72%和3.88%,DNMT3A DMR2高甲基化组的患者甲基化密度高于低甲基化组(随机挑选的两例对照组甲基化密度为60.34%和74.49%)。低甲基化与患者的年龄、性别、外周血白细胞计数、血红蛋白含量、血小板计数、FAB分型、WHO分型及染色体核型无关(P0.05)。DNMT3A DMR2低甲基化与DNMT3A基因、NPM1基因、FLT3基因、IDH1/2基因、C/EBPA基因、C/KIT基因、U2AF1基因以及RAS基因突变均无关(P0.05)。DNMT3A DMR2高甲基化组与低甲基化组患者经诱导治疗后的完全缓解率(CR)相似(分别为52.5%和48.3%)。DNMT3A DMR2低甲基化患者的总体生存时间(OS)明显短于高甲基化患者(两组患者中位生存时间分别为7个月和11个月,P=0.034)。在非M3患者(两组患者中位生存时间分别为7个月和9个月,P=0.019)和核型正常患者(两组患者中位生存时间分别为7个月和25个月,P=0.011)中,低甲基化患者的总体生存时间同样短于高甲基化患者。多因素分析显示,在核型正常AML患者中,DNMT3A DMR2低甲基化是一个独立的预后不良影响因素。DNMT3A四种异构体的表达均与DNMT3A DMR2的甲基化无相关性。(2)CML中DNMT3A DMR2甲基化82例CML患者中,60例(73%)为DNMT3A DMR2低甲基化,随机挑选的两例高甲基化患者BSP测序结果示甲基化密度为50.34%和37.16%,两例低甲基化患者甲基化密度为2.07%和3.02%。低甲基化与患者的年龄、性别、外周血白细胞计数、血红蛋白含量、血小板计数以及核型分组无关(P0.05)。慢性期、加速期、急变期患者DNMT3A DMR2低甲基化频率分别为72%(46/64)、100%(5/5)、69%(9/13),三组间差异无统计学意义(P0.05)。(3)MDS中DNMT3A DMR2甲基化90例MDS患者中,64例(71%)为DNMT3A DMR2低甲基化,随机挑选的两例高甲基化患者BSP测序结果示甲基化密度为45.3%和51.7%,两例低甲基化患者甲基化密度为0.49%和1.72%。低甲基化与患者的年龄、性别、外周血白细胞计数、血红蛋白含量、血小板计数无关(P0.05)。低甲基化与患者的WHO分型、核型危险分级以及国际预后评分系统(IPSS)分组无相关性(P0.05),DNMT3A DMR2低甲基化与DNMT3A基因、IDH1/2基因、U2AF1基因、SF3B1基因突变均无关(P0.05)。尽管DNMT3A DMR2低甲基化组的生存时间(中位生存时间为20个月)较DNMT3A DMR2高甲基化组(中位生存时间为33个月)为短,但该差异无统计学意义(P0.05)。结论(1)DNMT3A DMR2低甲基化是造血系统髓系肿瘤AML、CML和MDS患者中的一个常见分子事件;(2)在核型正常AML患者中,DNMT3A DMR2低甲基化是一个独立的预后不良影响因素;(3)DNMT3A DMR2低甲基化与MDS患者预后无关。
【关键词】：DNMT3A基因 甲基化 急性髓系白血病 慢性髓系白血病 骨髓增生异常综合征 RQ-PCR RQ-MSP
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.7;R551.3
【目录】：
  • 摘要5-7
  • ABSTRACT7-14
  • 英文缩略语14-16
  • 第一章 引言16-23
  • 1. DNMT3A基因与髓系肿瘤的研究进展16-23
  • 1.1 DNA甲基化与髓系肿瘤16-17
  • 1.2 DNA甲基转移酶17-18
  • 1.3 DNMT3A基因18-19
  • 1.4 DNMT3A基因与髓系肿瘤19-23
  • 1.4.1 AML19-20
  • 1.4.2 CML20-22
  • 1.4.3 MDS22-23
  • 第二章 本论文研究的目的、方法及实验方案的设计、意义23-26
  • 2.1 研究目的23
  • 2.2 研究方法及技术23-24
  • 2.2.1 实时荧光定量PCR（RQ-PCR）23
  • 2.2.2 实时定量甲基化特异性PCR（RQ-MSP）23-24
  • 2.2.3 亚硫酸氢盐测序24
  • 2.3 实验方案的设计24-25
  • 2.4 本研究的意义25-26
  • 第三章 AML患者中DNMT3A DMR2甲基化研究26-46
  • 3.1 材料26-28
  • 3.1.1 研究对象26
  • 3.1.2 主要试剂26-27
  • 3.1.3 主要仪器27
  • 3.1.4 引物27-28
  • 3.2 方法28-35
  • 3.2.1 骨髓单个核细胞分离、RNA及基因组DNA提取28-29
  • 3.2.2 DNA修饰（Epitect? Bisulfite Kit修饰DNA）29-30
  • 3.2.3 逆转录30
  • 3.2.4 DNMT3A四种异构体表达的RQ-PCR检测30-31
  • 3.2.5 DNMT3A DMR2的RQ-MSP检测31-32
  • 3.2.6 PCR产物纯化回收32
  • 3.2.7 重组载体构建32-33
  • 3.2.8 重组质粒转化33
  • 3.2.9 重组质粒提取33-34
  • 3.2.10 质粒鉴定、测序34
  • 3.2.11 阳性模板建立34
  • 3.2.12 细胞遗传学检查34
  • 3.2.13 基因突变检测34-35
  • 3.2.14 统计学处理35
  • 3.3 结果35-44
  • 3.3.1 RQ-PCR方法灵敏度重复性特异性35-36
  • 3.3.2 RQ-MSP灵敏度、重复性、特异性36-38
  • 3.3.3 对照组及AML患者中DNMT3A DMR2甲基化水平38-40
  • 3.3.4 AML中DNMT3A DMR2甲基化水平与临床相关性40-41
  • 3.3.5 DNMT3A DMR2甲基化态势与AML患者预后分析41-43
  • 3.3.6 AML患者中DNMT3A甲基化与表达相关性分析43-44
  • 3.4 讨论44-46
  • 第四章 CML患者中DNMT3A DMR2甲基化研究46-52
  • 4.1 材料46-47
  • 4.1.1 研究对象46
  • 4.1.2 主要试剂46
  • 4.1.3 主要仪器46
  • 4.1.4 引物46-47
  • 4.2 方法47
  • 4.2.1 骨髓单个核细胞分离、总RNA及基因组DNA制备47
  • 4.2.2 DNA亚硫酸盐修饰47
  • 4.2.3 DNMT3A DMR2 RQ-MSP检测47
  • 4.2.4 PCR产物的纯化回收47
  • 4.2.5 重组载体构建47
  • 4.2.6 重组质粒转化47
  • 4.2.7 重组质拉提取47
  • 4.2.8 质粒鉴定、测序47
  • 4.2.9 阳性模板建立47
  • 4.2.10 细胞遗传学检查47
  • 4.2.11 统计学处理47
  • 4.3 结果47-50
  • 4.3.1 对照组及CML患者DNMT3A DMR2甲基化水平47-49
  • 4.3.2 DNMT3A DMR2甲基化与临床相关性49-50
  • 4.4 讨论50-52
  • 第五章 MDS患者中DNMT3A DMR2甲基化研究52-59
  • 5.1 材料52-53
  • 5.1.1 研究对象52-53
  • 5.1.2 主要试剂53
  • 5.1.3 主要仪器53
  • 5.1.4 引物53
  • 5.2 方法53-54
  • 5.2.1 骨髓单个核细胞分离、总RNA及基因组DNA制备53
  • 5.2.2 DNA亚硫酸盐修饰53
  • 5.2.3 DNMT3A DMR2 RQ-MSP检测53
  • 5.2.4 PCR产物的纯化回收53
  • 5.2.5 重组载体构建53
  • 5.2.6 重组质粒转化53
  • 5.2.7 重组质拉提取53
  • 5.2.8 质粒鉴定、测序53
  • 5.2.9 阳性模板建立53
  • 5.2.10 细胞遗传学检查53-54
  • 5.2.11 基因突变检测54
  • 5.2.12 统计学处理54
  • 5.3 结果54-57
  • 5.3.1 对照组及MDS患者DNMT3A DMR2甲基化水平54-56
  • 5.3.2 MDS患者中DNMT3A DMR2甲基化与临床相关性56-57
  • 5.3.3 DNMT3A DMR2甲基化态势与MDS患者预后分析57
  • 5.4 讨论57-59
  • 第六章 结论和展望59-60
  • 6.1 主要结论59
  • 6.2 展望59-60
  • 参考文献60-71
  • 致谢71-73
  • 攻读硕士学位期间发表的学术论文及其他科研成果73

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本文编号：341264

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