嗜热毛壳菌β-葡萄糖苷酶BGL3基因的克
发布时间：2021-10-05 11:37
纤维素是地球上分布范围广泛、含量丰富的天然高分子多糖类物质。它的高效利用可以解决资源枯竭、环境污染等重大问题。纤维素酶是多组分酶,其中β-葡萄糖苷酶是降解纤维素的关键限速酶。本研究以嗜热毛壳菌（Chaetomium thermophilum）为实验材料,对糖苷水解酶第三家族β-葡萄糖苷酶活性通道内的非保守氨基酸以及酶催化中心可能与底物结合的保守氨基酸进行了定点突变,研究突变酶的酶学性质,筛选出了酶与底物结合的关键氨基酸位点及热稳定性强的突变酶。主要研究结果如下:克隆了来自嗜热毛壳菌糖苷水解酶第三家族β-葡萄糖苷酶的基因bgl3,将其导入毕赤酵母中表达,对表达的蛋白进行分离和纯化。SDS-PAGE电泳检测蛋白纯化产物,蛋白大小为120kDa,比预测的理论分子量大,说明蛋白翻译过程中发生了糖基化的修饰,得到野生酶BGL3。BGL3的比活力为36.1U/mg,酶促反应最适温度和pH值分别为60℃和5.0。Km、kcat、kcat/Km值为4.27±0.032mM、20.16±0.13s-1
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
-1β-葡萄糖苷酶的反转型和保留型催化机制Fig.1.3-1Reversedandretainedcatalyticmechanismofβ-glucosidase
2.5-1 嗜热毛壳菌糖苷水解酶第三家族β-葡萄糖苷酶蛋白结构模绿色：突变位点；红色：酶活性位点；蓝色：葡萄糖2.5-1 protein structural model of GH3 β-glucosidase from C. thermoGreen: mutation site; Red: enzyme activity site; Blue: glucose物设计表 2.5-2 β-葡萄糖苷酶非保守氨基酸突变位点引物序列2 Non-conservative amino acid mutation site primer sequences of βame Primer sequence FP: TTGGCAGGAT GCCTGCTGGTGCTCGGAATTGGGRP:AGCACCAGCAGGCATCCTGCCAAGTGGGCCAGC FP: GTGCTAAGCATCTTATTGGCTACGAGCAAGAACRP: GTAGCCAATAAGATGCTTAGCACAGGCAATAACA FP: GAGTTGGTTCCGTCATGTGCTCCTACAACCAGGTRP: GGAGCACATGACGGAACCAACTCCGGCACGAAC FP: TTGGCTTCCAGGGTTTCGTTCAGAGCGACTGGCA
山东农业大学硕士学位论文B: 5ju6），二者序列的相似度为 62.74%。利用 PDBsum 网站分析 Cel3A（PDB: 5ju6）的蛋白结构信息，寻找酶与底物结酸位点（图 2.5-3）。根据 Cel3A 蛋白的二级结构和 Clustal 软件，分析得出 B酸序列中 V67、D85、R91、L134、R149、K182、H183、R193、M234、Y2370 位点可能在酶催化水解底物时发挥关键的作用。将这些氨基酸位点都突变为A，研究酶催化中心执行主要功能的氨基酸位点，本研究为糖苷水解酶第三家族苷酶的进一步分子改造提供一定的参考。
【参考文献】：
期刊论文
[1]His159突变对嗜热革节孢EGⅡ活性及热稳定性的影响[J]. 高金鹏,刘玉姣,刘宁,王欢,李多川. 农业生物技术学报. 2017(11)
[2]定点突变技术提高β-葡萄糖苷酶活性[J]. 李沛华,郭雪睿,彭继燕,陈惠,唐自钟,金伟琼,王欢,韩学易. 基因组学与应用生物学. 2016(08)
[3]β-葡萄糖苷酶研究进展[J]. 杨晓宽. 河北科技师范学院学报. 2012(01)
[4]β-葡萄糖苷酶的制备及在纤维素辅助水解上的应用研究[J]. 瞿丽莉,朱均均,刘敏,勇强,余世袁. 林产化学与工业. 2009(01)
[5]β-葡萄糖苷酶基因的克隆与表达研究进展[J]. 韩笑,陈介南,王义强,何钢,刘海波,谭力. 生物技术通报. 2008(03)
[6]β-葡萄糖苷酶纯化及酶学性质研究[J]. 谢宇,尚晓娴,胡金刚. 江西农业大学学报. 2008(03)
[7]β-葡萄糖苷酶的研究及应用进展[J]. 潘利华,罗建平. 食品科学. 2006(12)
[8]嗜热毛壳菌外切葡聚糖纤维二糖水解酶的纯化和部分性质研究[J]. 李亚玲,李多川,滕芳超. 微生物学报. 2006(01)
[9]β-葡萄糖苷酶对豆奶及豆奶粉中大豆异黄酮糖苷化合物的转化作用研究[J]. 徐茂军. 中国食品学报. 2005(04)
[10]嗜热毛壳菌纤维素酶（CBHⅡ）cDNA的克隆及在毕赤酵母中的表达[J]. 刘守安,李多川,俄世瑾,张燕. 生物工程学报. 2005(06)
博士论文
[1]嗜热真菌糖苷酶的基因克隆、表达与分子改造[D]. 徐荣燕.山东农业大学 2010
硕士论文
[1]糖苷水解酶GH12家族活性架构中关键氨基酸的功能分析[D]. 李单单.山东大学 2013
本文编号：3419660
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
-1β-葡萄糖苷酶的反转型和保留型催化机制Fig.1.3-1Reversedandretainedcatalyticmechanismofβ-glucosidase
2.5-1 嗜热毛壳菌糖苷水解酶第三家族β-葡萄糖苷酶蛋白结构模绿色：突变位点；红色：酶活性位点；蓝色：葡萄糖2.5-1 protein structural model of GH3 β-glucosidase from C. thermoGreen: mutation site; Red: enzyme activity site; Blue: glucose物设计表 2.5-2 β-葡萄糖苷酶非保守氨基酸突变位点引物序列2 Non-conservative amino acid mutation site primer sequences of βame Primer sequence FP: TTGGCAGGAT GCCTGCTGGTGCTCGGAATTGGGRP:AGCACCAGCAGGCATCCTGCCAAGTGGGCCAGC FP: GTGCTAAGCATCTTATTGGCTACGAGCAAGAACRP: GTAGCCAATAAGATGCTTAGCACAGGCAATAACA FP: GAGTTGGTTCCGTCATGTGCTCCTACAACCAGGTRP: GGAGCACATGACGGAACCAACTCCGGCACGAAC FP: TTGGCTTCCAGGGTTTCGTTCAGAGCGACTGGCA
山东农业大学硕士学位论文B: 5ju6），二者序列的相似度为 62.74%。利用 PDBsum 网站分析 Cel3A（PDB: 5ju6）的蛋白结构信息，寻找酶与底物结酸位点（图 2.5-3）。根据 Cel3A 蛋白的二级结构和 Clustal 软件，分析得出 B酸序列中 V67、D85、R91、L134、R149、K182、H183、R193、M234、Y2370 位点可能在酶催化水解底物时发挥关键的作用。将这些氨基酸位点都突变为A，研究酶催化中心执行主要功能的氨基酸位点，本研究为糖苷水解酶第三家族苷酶的进一步分子改造提供一定的参考。
【参考文献】：
期刊论文
[1]His159突变对嗜热革节孢EGⅡ活性及热稳定性的影响[J]. 高金鹏,刘玉姣,刘宁,王欢,李多川. 农业生物技术学报. 2017(11)
[2]定点突变技术提高β-葡萄糖苷酶活性[J]. 李沛华,郭雪睿,彭继燕,陈惠,唐自钟,金伟琼,王欢,韩学易. 基因组学与应用生物学. 2016(08)
[3]β-葡萄糖苷酶研究进展[J]. 杨晓宽. 河北科技师范学院学报. 2012(01)
[4]β-葡萄糖苷酶的制备及在纤维素辅助水解上的应用研究[J]. 瞿丽莉,朱均均,刘敏,勇强,余世袁. 林产化学与工业. 2009(01)
[5]β-葡萄糖苷酶基因的克隆与表达研究进展[J]. 韩笑,陈介南,王义强,何钢,刘海波,谭力. 生物技术通报. 2008(03)
[6]β-葡萄糖苷酶纯化及酶学性质研究[J]. 谢宇,尚晓娴,胡金刚. 江西农业大学学报. 2008(03)
[7]β-葡萄糖苷酶的研究及应用进展[J]. 潘利华,罗建平. 食品科学. 2006(12)
[8]嗜热毛壳菌外切葡聚糖纤维二糖水解酶的纯化和部分性质研究[J]. 李亚玲,李多川,滕芳超. 微生物学报. 2006(01)
[9]β-葡萄糖苷酶对豆奶及豆奶粉中大豆异黄酮糖苷化合物的转化作用研究[J]. 徐茂军. 中国食品学报. 2005(04)
[10]嗜热毛壳菌纤维素酶（CBHⅡ）cDNA的克隆及在毕赤酵母中的表达[J]. 刘守安,李多川,俄世瑾,张燕. 生物工程学报. 2005(06)
博士论文
[1]嗜热真菌糖苷酶的基因克隆、表达与分子改造[D]. 徐荣燕.山东农业大学 2010
硕士论文
[1]糖苷水解酶GH12家族活性架构中关键氨基酸的功能分析[D]. 李单单.山东大学 2013
本文编号：3419660
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3419660.html
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