YAP基因对口腔鳞癌细胞系CAL27增殖凋亡的影响及机制研究

发布时间：2021-10-07 21:52

　　研究背最及目的:口腔鳞状细胞癌是口腔颌面部最为常见的恶性肿瘤之一,每年有超过28万新增的病例。中国是口腔鳞癌的高发地区,近年来的发病呈上升趋势。虽然目前已有新型的化疗方法和靶向治疗药物应用于临床,但其效果不甚理想,因此我们需深入了解口腔鳞癌的发生发展机制。Hippo信号通路下游的关键效应分子YAP已被报道在肝癌、肺癌等肿瘤组织中表达异常。因此,本课题旨在探讨YAP对口腔鳞癌细胞CAL27的增殖和凋亡的影响,并研究其在体内体外促肿瘤的作用和机制,为YAP基因作为口腔鳞癌治疗新的靶点提供理论依据。实验方法:1.用免疫组化法检测不同分化程度的口腔鳞癌和正常口腔上皮组织中YAP蛋白的表达情况。2.检测YAP在4株口腔鳞状细胞癌细胞系中的表达水平,并选择CAL27作为进一步的实验材料。利用慢病毒载体转染CAL27细胞,分别构建敲除和过表达YAP基因及对照组的口腔鳞癌细胞系。通过QRT-PCR及Western blot检测敲除和过表达效率。3.利用CCK-8细胞活力实验,EdU染色法,克隆形成实验来检测敲除和过表达YAP对CAL27细胞增殖的影响;流式细胞术检测YAP对细胞周期和细胞凋亡的影响。通... 

【文章来源】：山东大学山东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：58 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图１：?ＹＡＰ在口腔鳞癌中的表达水平??

ＹＡＰ蛋白在口腔鳞癌细胞系的作用。为此，我们选择了?４种口腔来源的鳞癌细??胞系０耍保蓿玻贰?耍玻担场⒍。鞍耍福保保澈兔瘢赶赴???茫ǎ?保倍。?浚埃焙停埽ぃ叮担保叮保保蓿暴枺奔欤崳?测ＹＡＰ基因和蛋白的表达水平。结果显示，ＹＡＰ基因和蛋白的表达水平在??Ａ２５３细胞中表达水平最低，而在ＴＣＡ８１１３细胞中表达水平最高（图２－１Ａ、图??２－１Ｂ）。最后，我们选择ＣＡＬ２７细胞进行后续的实验。我们利用慢病毒构建稳??定敲除和过表达ＹＡＰ的ＣＡＬ２７细胞系，嘌呤霉素筛选，ＣＡＬ２７细胞在明场和??蓝色荧光下形态如图所示（图２－１Ｃ、图２－１Ｄ）。??Ａ．?Ｂ．?亏??＞?．??ｉ－＇?１??ＹＡＰ?—＞?彡??ｇａｐｄｈ?ｍｍ?ｍａｍ?％?２?＼?￣?＇??Ａ２５３?ＫＢ?ＣＡＬ２７?ＩＣＡ８Ｍ３．?｜?｝ｕ?ＨＨＩ??３?Ａ：？?？?＇Ｉ?：？?ＫＢ?ｒＣＡＭＩ＊??ｃ?１）．?＿＿＿＿＿＿＿＿??■?■??图２－１：细胞系的筛选及转染??Ａ、Ｂ：?ＹＡＰ在四种口腔鳞癌细胞系中表达情况；Ｃ、Ｄ：明场和蓝色荧光??下?ＣＡＬ２７?细胞的情况?＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１．??２）稳定敲除和过表达ＹＡＰ基因ＣＡＬ２７细胞的构建??随后，我们利用ＱＲＴ－ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ技术检测敲除和过表达效率。结??果显示，在敲除ＹＡＰ后，ＹＡＰ及其下游靶基因ＣＴＧＦ、ＣＹＲ６１及ＡＮＫＲＤ表??达水平均降低（Ｐ＜〇．〇５）（图２－２Ａ）；过表达ＹＡＰ后，ＹＡＰ及其靶基因均升??高

（０．５６４?±０．０３３）较ｓｈ－ＮＣ?（０．８０２?±０．００７）要低，差异有统计学意义??（Ｐ＜０．００１），而在随后的第四、五、六天也保持着这种差异。但在第七天，两??者间差别无统计学意义，推测与细胞长满培养板有关（图２－３Ａ）。ＥｄＵ染色结??果显示，ｓｈ－ＹＡＰ组细胞阳性着色比例（３２．６３９±２．６８３）较ｓｈ－ＮＣ组（４８．５４４土??４．５８２）要低（图２－３Ｂ、图２－３Ｃ），差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１），说明ｓｈ－??ＹＡＰ组处于分裂期的细胞较ｓｈ－ＮＣ组要少。克隆形成实验结果显示，在敲除??ＹＡＰ基因后，ｓｈ－ＹＡＰ组克隆形成数目较ｓｈ－ＮＣ组要少（图２－３Ｄ、图２－３Ｅ），??差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）

【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3422840