奶山羊INSIG基因对乳腺上皮细胞中脂代谢的影响研究

发布时间：2017-05-03 11:07

  本文关键词：奶山羊INSIG基因对乳腺上皮细胞中脂代谢的影响研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：胰岛素诱导基因(Insulin-induced genes,INSIGs)是调控脂代谢的重要因子,为内质网膜蛋白,包括INSIG1和INSIG2两个亚型。其两个亚型在不同组织中的生物学功能及表达调控机理存在一定的差异,尚未见到有关INSIGs基因在山羊乳腺细胞脂质代谢中的功能研究。本研究以西农萨能奶山羊乳腺组织为材料,利用实时荧光定量(q RT-PCR)检测INSIGs不同亚型在不同泌乳时期的表达情况。构建INSIG1和INSIG2基因的重组腺病毒超表达载体,包装出高滴度的腺病毒,设计并合成特异性沉默INSIG1和INSIG2基因的si RNA,研究INSIGs基因超表达或干扰后对山羊乳腺上皮细胞(GMEC)中脂代谢相关基因、甘油三酯(TAG)含量、总胆固醇(TC)含量及脂滴积累的影响,为该基因在奶山羊脂代谢中的功能研究提供理论依据。本研究获得的结果如下:(1)在山羊整个泌乳周期中,乳腺中INSIG1和INSIG2基因的表达趋势较为相似,均在泌乳前期表达量最高,干奶期表达量最低。(2)INSIGs两个亚型均具有跨膜蛋白特性结构,均含有5个跨膜结构,且两者的保守区域集中在跨膜区,该区域的核苷酸相似性为71%,氨基酸相似性为80%。(3)成功构建奶山羊INSIG1基因重组腺病毒超表达载体,获得具有较高滴度(2×108U/m L)的超表达腺病毒(Ad-INSIG1)。Ad-INSIG1感染山羊乳腺上皮细胞48 h后,INSIG1基因的m RNA表达量上调约500倍,SREBP1和SCAP的m RNA水平无显著变化,但能够显著下调细胞中脂代谢相关基因的表达:脂肪酸从头合成(ACCα、FASN)及去饱和(SCD1)、TAG合成(GPAM、DGAT2)及TAG分解(ATGL)。同时,细胞内TAG含量无显著变化,TC含量显著下降,脂滴的积累减少。(4)成功构建奶山羊INSIG2基因重组腺病毒超表达载体,获得了具有较高滴度(3×108 U/m L)的超表达腺病毒(Ad-INSIG2)。Ad-INSIG2感染山羊GMEC48 h后,INSIG2基因的m RNA表达量上调约50倍,SREBP1和SCAP的m RNA水平无显著变化,但能够显著下调细胞中脂代谢相关基因的表达:INSIG1、FA从头合成(ACCα)、FA去饱和(SCD1)、TAG合成(AGPAT6、DGAT2)及TAG分解(HSL)。同时,细胞内TAG含量、TC含量及脂滴的积累均显著下降。(5)针对INSIG1和INSIG2基因分别各设计两对si RNA序列(si INSIG1-100、si INSIG1-547、si INSIG2-175及si INSIG2-244),其中si INSIG1-547、si INSIG2-175转染山羊乳腺上皮细胞48 h后,INSIG1和INSIG2基因的表达量分别下降了80%左右。同时转染这两对si RNA时,能有效沉默INSIG1和INSIG2的表达(-80%)。在山羊乳腺上皮细胞中,单独干扰INSIG1或INSIG2时,能在一定程度上上调脂代谢相关基因的表达、TAG含量及脂滴积累,TC含量显著上调;当同时干扰INSIG1和INSIG2时,能够显著刺激脂合成相关基因的表达,促进细胞中TAG和TC的积累,脂滴积累也明显增加。本研究表明,INSIG1和INSIG2均能调控山羊乳腺上皮细胞中脂代谢相关基因的表达,超表达INSIGs能抑制细胞中脂质积累,单独干扰INSIG1或INSIG2时,细胞中脂代谢无显著变化,只有同时干扰INSIGs两个亚型才能解除对脂质积累的抑制作用。相较于INSIG1,INSIG2可能对TAG代谢的影响更大。
【关键词】：INSIGs 山羊乳腺上皮细胞 超表达 RNA干扰 脂代谢
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S827
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-14
• 第一章 文献综述14-24
• 1.1 INSIG基因的发现14-15
• 1.2 INSIGs的分子结构15
• 1.3 INSIGs的功能15-18
• 1.3.1 INSIGs参与固醇介导的SREBPs蛋白调控16-18
• 1.3.2 INSIGs参与固醇介导的HMGR蛋白调控18
• 1.4 INSIGs的表达及调控18-20
• 1.5 INSIGs的研究进展20-23
• 1.5.1 INSIG与PPAR对脂代谢的调控及代谢综合征相关20-21
• 1.5.2 INSIGs与micro RNA对脂代谢的调控相关21
• 1.5.3 INSIGs多态性与肥胖相关21-22
• 1.5.4 INSIGs与癌症相关22-23
• 1.6 本研究的目的及意义23-24
• 第二章 INSIGs两个亚型在山羊乳腺的表达丰度及序列比对情况24-31
• 2.1 材料与方法24-26
• 2.1.1 样品24
• 2.1.2 试验试剂24
• 2.1.3 仪器设备24
• 2.1.4 样品采集24-25
• 2.1.5 西农萨能奶山羊乳腺组织总RNA的提取及c DNA的合成25
• 2.1.6 山羊不同泌乳时期乳腺组织中INSIGs的表达丰度检测25-26
• 2.1.7 山羊INSIGs序列生物信息学分析26
• 2.2 结果与分析26-29
• 2.2.1 乳腺组织总RNA的提取结果26-27
• 2.2.2 不同泌乳时期山羊乳腺组织中INSIGs的表达情况27
• 2.2.3 山羊INSIG1和INSIG2基因CDS区的差异27-29
• 2.3 讨论29-30
• 2.3.1 不同泌乳时期山羊乳腺组织中INSIGs表达丰度的比较29
• 2.3.2 山羊INSIGs两个亚型间的序列比较29-30
• 2.4 小结30-31
• 第三章 超表达INSIG1对GMEC中脂代谢的影响研究31-46
• 3.1 材料与方法31-38
• 3.1.1 材料31
• 3.1.2 试验试剂及仪器设备31
• 3.1.3 INSIG1基因的扩增31-33
• 3.1.4 pAdTrack-CMV-INSIG1腺病毒穿梭载体的构建33
• 3.1.5 pAdEasy-INSIG1重组腺病毒载体的构建及鉴定33-34
• 3.1.6 Ad-INSIG1腺病毒的包装、扩增及滴度测定34-35
• 3.1.7 腺病毒感染GMEC最佳MOI值(multiplicity of infection)的测定35-36
• 3.1.8 Ad-INSIG1腺病毒超表达效果检测36
• 3.1.9 超表达INSIG1基因对脂质合成相关基因表达的影响36
• 3.1.10 超表达INSIG1基因后GMEC中TAG及TC含量的影响36-37
• 3.1.11 超表达INSIG1基因对GMEC中脂滴积累的影响37-38
• 3.2 结果与分析38-43
• 3.2.1 INSIG1基因的扩增与鉴定38
• 3.2.2 pAdTrack-CMV-INSIG1腺病毒穿梭载体的构建与鉴定38-39
• 3.2.3 pAdEasy-INSIG1重组腺病毒载体的构建与鉴定39-40
• 3.2.4 腺病毒的包装、扩增与滴度测定40
• 3.2.5 腺病毒感染GMEC最佳MOI值的确定40-41
• 3.2.6 Ad-INSIG1腺病毒超表达效果检测41
• 3.2.7 超表达INSIG1基因对脂质合成相关基因表达的影响41-42
• 3.2.8 超表达INSIG1基因对细胞中TAG、TC含量的影响42-43
• 3.2.9 超表达INSIG1基因对细胞中脂滴积累的影响43
• 3.3 讨论43-45
• 3.3.1 Ad-INSIG1超表达腺病毒的包装43-44
• 3.3.2 超表达INSIG1基因对GMEC中脂代谢相关基因的影响44-45
• 3.3.3 超表达INSIG1基因对GMEC中脂滴积累的影响45
• 3.4 小结45-46
• 第四章 超表达INSIG2对GMEC中脂代谢的影响研究46-57
• 4.1 材料与方法46-49
• 4.1.1 试验材料46
• 4.1.2 试验试剂及仪器设备46
• 4.1.3 INSIG2基因的扩增46-47
• 4.1.4 pAdTrack-CMV-INSIG2腺病毒穿梭载体的构建47
• 4.1.5 pAdEasy-INSIG2重组腺病毒载体的构建及鉴定47-48
• 4.1.6 Ad-INSIG2腺病毒的包装、扩增及滴度测定48
• 4.1.7 腺病毒感染GMEC最佳MOI值(multiplicity of infection)的测定48
• 4.1.8 Ad-INSIG2腺病毒超表达效果检测48
• 4.1.9 超表达INSIG2基因对脂质合成相关基因表达的影响48
• 4.1.10 超表达INSIG2基因对GMEC中TAG及TC含量的影响48-49
• 4.1.11 超表达INSIG2基因对GMEC中脂滴积累的影响49
• 4.2 结果与分析49-54
• 4.2.1 INSIG2基因的扩增与鉴定49
• 4.2.2 pAdTrack-CMV-INSIG2腺病毒穿梭载体的构建与鉴定49-50
• 4.2.3 pAdEasy-INSIG2重组腺病毒载体的构建与鉴定50-51
• 4.2.4 腺病毒的包装、扩增与滴度测定51
• 4.2.5 腺病毒感染GMEC最佳MOI值的确定51-52
• 4.2.6 Ad-INSIG2腺病毒超表达效果检测52
• 4.2.7 超表达INSIG2基因对脂质合成相关基因表达的影响52-53
• 4.2.8 超表达INSIG2基因对细胞中TAG、TC含量的影响53-54
• 4.2.9 超表达INSIG2基因对细胞中脂滴积累的影响54
• 4.3 讨论54-56
• 4.3.1 Ad-INSIG2超表达腺病毒的包装54-55
• 4.3.2 超表达INSIG2基因对GMEC中脂代谢相关基因的影响55
• 4.3.3 超表达INSIG2基因对GMEC中脂质积累的影响55-56
• 4.4 小结56-57
• 第五章 干扰INSIGs对GMEC中脂代谢的影响研究57-66
• 5.1 材料与方法57-59
• 5.1.1 试验试剂57
• 5.1.2 仪器设备57
• 5.1.3 奶山羊INSIGs基因si RNA的设计与合成57-58
• 5.1.4 siRNA干扰效率检测58
• 5.1.5 干扰INSIGs基因的表达对脂代谢相关基因表达的影响58-59
• 5.1.6 干扰INSIGs基因的表达对GMEC中TAG及TC含量的影响59
• 5.1.7 干扰INSIGs基因的表达对GMEC中脂滴积累的影响59
• 5.2 结果与分析59-63
• 5.2.1 siRNA干扰效率检测59-61
• 5.2.2 干扰INSIGs基因的表达对脂质合成相关基因表达的影响61
• 5.2.3 干扰INSIGs基因的表达对GMEC中TAG及TC含量的影响61-62
• 5.2.4 干扰INSIGs基因的表达对GMEC中脂滴积累的影响62-63
• 5.3 讨论63-65
• 5.3.1 siRNA的设计63-64
• 5.3.2 干扰INSIGs基因的表达对脂代谢相关基因的影响64
• 5.3.3 干扰INSIGs基因的表达对脂质积累的影响64-65
• 5.4 小结65-66
• 结论66-67
• 缩略词67-68
• 参考文献68-74
• 附录 174-75
• 附录 275-76
• 附录 376-77
• 致谢77-78
• 作者简介78

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