维吉尼亚链霉菌IBL-14 I-B-sviCas3系统在酿酒酵母BY4741中的基因编辑及脱靶分析
发布时间：2021-10-13 16:26
基因编辑（gene editing）,又称基因组编辑（genome edting）或基因组工程（genome engineering）,是通过对生物体某些特定的基因进行比较精确的增添或者删减从而满足人类的某些需求衍生出的一项基因工程技术或过程。与传统的基因工程相比较,基因编辑可以直接作用于细胞染色体的特性,使得其实用性获得了更大的提升。CRISPR/Cas是目前基因编辑领域最前沿最火热的基因编辑技术,其低成本高效率易操作的优点大大促进了基因编辑技术的发展。CRISPR/Cas系统广泛存在于自然界细菌和古生菌中,是细菌和古生菌面对外源DNA的入侵而产生的一种自我免疫的机制。对CRISPR/Cas系统的研究发现CRISPR-Cas9和V型Cpf1具有基因编辑的作用,其中CRISPR-Cas9最具有典型性,但是CRISPR-Cas9也存在着对某些生物不相融,高脱靶率的问题。通过对本实验室自行分离纯化得到的维吉尼亚链霉菌IBL14（Streptomyces virginiae IBL14）的全基因组测序发现其染色体的两个CRISPR位点之间存在着一个Cas顺序为cas7,cas5,cas3,c...
【文章来源】：安徽大学安徽省 211工程院校
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
CRISPR-Cas系统免疫原理
制药厂污泥中发现并分离提纯而来的一种放线菌，在革兰氏染色实验中发现其为阳性菌株，初步实验后本实验室委托苏州众信生物技术有限公司对IBL14进行了全基因组的测序。通过全基因组的分析发现该生物存在着cas3介导的CRISPR-Cas系统，之后的对比分析中我们可以确认该系统属于Ⅱ型CRISPR-Cas系统的一个亚型[25]。对IBL14全基因组进行分析时我们发现其存在着18个CRISPER位点，其中两个位点之间存在着一个Cas顺序为cas7,cas5,cas3,cas4,cas1,cas2的蛋白群，他们位于同一操纵子上，我们将其命名为I-B-svi型CRISPR-Cas系统[26]。图1.3I-B-svi型CRISPR-Cas系统结构Figure1.3thestructureofI-B-sviCRISPR-Cassystem本实验室对I-B-svi型CRISPR-Cas系统的开发一直都在紧锣密鼓的进行着，其中雍德祥[27]，许鑫[28]，邱彩花[29]对利用本系统自打靶做出了突出贡献，杨兴旺[30]，孙焰[31]利用该系统在大肠杆菌中实现了基因编辑,夏婷婷[32]拓展了本系统在谷氨酸棒状杆菌中的应用，曹素丽[33]一直在进行原始菌株的工作。唐严严[34]更是实现了该系统在人体细胞中基因编辑的突破。王安静[35]利用I-B-sviCRISPR-Cas系统对真核微生物进行了基因敲除。1.3研究的意义内容和方案1.3.1CRISPR-Cas系统指导基因组编辑的分子原理当同源DNA序列存在时，宿主基因组中末端错位的致命双链断裂(DSB)DNA通常可以通过细胞自身的同源指导修复(HDR)机制(频率较低，错误较少)修复[36]，这种修复通过将两端分别有两个互补序列的工程同源DNA片段(或模板DNA/t-DNA)引入到DSB产品的末端来构建基因组编辑的基础[37]。此外当缺乏同源DNA序列时尤其是缺失钝端
第一章绪论4的基因组DSB产品中，会出现非同源性末端接合(NHEJ)(频率更高，错误更多)，这通常会导致核苷酸插入或缺失(indels)1的帧移位突变[38]。在CRISPR-Cas系统介导的内源性基因组编辑中，一系列基因编辑工具(通常包括t-DNA、g-DNA、Cas、遗传标记和载体/质粒)导入宿主细胞后产生的分子事件主要包括:(i)Cas基因的转录和翻译(通常包括t-DNA和载体的重复)，(ii)g-DNA的转录和加工形成crRNA，(iii)Cas对内源性DNA的定点切割，(iv)靶基因序列与t-DNA的同源重组。显然事件(i)和(iv)完全由宿主细胞和质粒中的分子组分实现，只有事件(ii)和(iii)应由Cas(es)1,2完成。实际上通过对crRNA进行优化，将由启动子、crRNAcDNA和终止子组成的g-DNA整合到载体中，可以很容易地实现上述功能[39]。因此基因组编辑中的事件(iii)是一个关键步骤应该通过具有相同功能的限制性内切酶来实现。图1.4CRISPR-Cas系统指导基因组编辑的分子原理Figure1.4ThemolecularprincipleofCRISPR-Cassystemguidinggenomeediting1.3.2本课题的研究意义探究碱基优化后的I-B-svi型CRISPR-Cas系统在酿酒酵母进行的基因敲除具有重要的意义，首先能够补充该系统在真核生物探究的缺失，进一步证明维吉尼亚链霉菌自身的CRISPR-Cas系统可应用到其它生物中。其次为基于2类II型与V型CRISPR-Cas系统进行的真核生物基因编辑提供了新的补充和选择。最后应用该系统对真核生物酿酒酵母基因组可方便、快速、有效地进行基因编辑。对脱靶实验的探究让整个实验更加的严谨也论证了我们对该系统低脱靶率的推理。
【参考文献】：
期刊论文
[1]番茄红素对非酒精性脂肪肝大鼠糖脂代谢及炎症水平的影响[J]. 张配配,李景贤,李蒙丽,隋源,周钰浩,孙永叶. 卫生研究. 2020(02)
[2]Cpf1核酸酶的原核表达、纯化及多克隆抗体制备与鉴定[J]. 董彬,王君,孙静,王报贵,孙春龙,吴涛. 生物学杂志. 2020(06)
硕士论文
[1]I-B-Svi型CRISPR-Cas3系统在哺乳动物细胞中的基因编辑[D]. 唐严严.安徽大学 2019
[2]I-B-Svi型CRISPR-Cas系统在谷氨酸棒状杆菌中的基因编辑[D]. 夏婷婷.安徽大学 2019
[3]酿酒酵母合成番茄红素的途径优化研究[D]. 李霞.石河子大学 2018
[4]维吉尼亚链霉菌IBL14中sviscsn基因簇功能分析[D]. 许鑫.安徽大学 2017
[5]维吉尼亚链霉菌IBL14中I-B-svi型CRISPR-Cas系统及青霉素代谢相关酶基因自敲除[D]. 邱彩花.安徽大学 2017
[6]维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统及其基因编辑方法[D]. 雍德祥.安徽大学 2016
本文编号：3434997
【文章来源】：安徽大学安徽省 211工程院校
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
CRISPR-Cas系统免疫原理
制药厂污泥中发现并分离提纯而来的一种放线菌，在革兰氏染色实验中发现其为阳性菌株，初步实验后本实验室委托苏州众信生物技术有限公司对IBL14进行了全基因组的测序。通过全基因组的分析发现该生物存在着cas3介导的CRISPR-Cas系统，之后的对比分析中我们可以确认该系统属于Ⅱ型CRISPR-Cas系统的一个亚型[25]。对IBL14全基因组进行分析时我们发现其存在着18个CRISPER位点，其中两个位点之间存在着一个Cas顺序为cas7,cas5,cas3,cas4,cas1,cas2的蛋白群，他们位于同一操纵子上，我们将其命名为I-B-svi型CRISPR-Cas系统[26]。图1.3I-B-svi型CRISPR-Cas系统结构Figure1.3thestructureofI-B-sviCRISPR-Cassystem本实验室对I-B-svi型CRISPR-Cas系统的开发一直都在紧锣密鼓的进行着，其中雍德祥[27]，许鑫[28]，邱彩花[29]对利用本系统自打靶做出了突出贡献，杨兴旺[30]，孙焰[31]利用该系统在大肠杆菌中实现了基因编辑,夏婷婷[32]拓展了本系统在谷氨酸棒状杆菌中的应用，曹素丽[33]一直在进行原始菌株的工作。唐严严[34]更是实现了该系统在人体细胞中基因编辑的突破。王安静[35]利用I-B-sviCRISPR-Cas系统对真核微生物进行了基因敲除。1.3研究的意义内容和方案1.3.1CRISPR-Cas系统指导基因组编辑的分子原理当同源DNA序列存在时，宿主基因组中末端错位的致命双链断裂(DSB)DNA通常可以通过细胞自身的同源指导修复(HDR)机制(频率较低，错误较少)修复[36]，这种修复通过将两端分别有两个互补序列的工程同源DNA片段(或模板DNA/t-DNA)引入到DSB产品的末端来构建基因组编辑的基础[37]。此外当缺乏同源DNA序列时尤其是缺失钝端
第一章绪论4的基因组DSB产品中，会出现非同源性末端接合(NHEJ)(频率更高，错误更多)，这通常会导致核苷酸插入或缺失(indels)1的帧移位突变[38]。在CRISPR-Cas系统介导的内源性基因组编辑中，一系列基因编辑工具(通常包括t-DNA、g-DNA、Cas、遗传标记和载体/质粒)导入宿主细胞后产生的分子事件主要包括:(i)Cas基因的转录和翻译(通常包括t-DNA和载体的重复)，(ii)g-DNA的转录和加工形成crRNA，(iii)Cas对内源性DNA的定点切割，(iv)靶基因序列与t-DNA的同源重组。显然事件(i)和(iv)完全由宿主细胞和质粒中的分子组分实现，只有事件(ii)和(iii)应由Cas(es)1,2完成。实际上通过对crRNA进行优化，将由启动子、crRNAcDNA和终止子组成的g-DNA整合到载体中，可以很容易地实现上述功能[39]。因此基因组编辑中的事件(iii)是一个关键步骤应该通过具有相同功能的限制性内切酶来实现。图1.4CRISPR-Cas系统指导基因组编辑的分子原理Figure1.4ThemolecularprincipleofCRISPR-Cassystemguidinggenomeediting1.3.2本课题的研究意义探究碱基优化后的I-B-svi型CRISPR-Cas系统在酿酒酵母进行的基因敲除具有重要的意义，首先能够补充该系统在真核生物探究的缺失，进一步证明维吉尼亚链霉菌自身的CRISPR-Cas系统可应用到其它生物中。其次为基于2类II型与V型CRISPR-Cas系统进行的真核生物基因编辑提供了新的补充和选择。最后应用该系统对真核生物酿酒酵母基因组可方便、快速、有效地进行基因编辑。对脱靶实验的探究让整个实验更加的严谨也论证了我们对该系统低脱靶率的推理。
【参考文献】：
期刊论文
[1]番茄红素对非酒精性脂肪肝大鼠糖脂代谢及炎症水平的影响[J]. 张配配,李景贤,李蒙丽,隋源,周钰浩,孙永叶. 卫生研究. 2020(02)
[2]Cpf1核酸酶的原核表达、纯化及多克隆抗体制备与鉴定[J]. 董彬,王君,孙静,王报贵,孙春龙,吴涛. 生物学杂志. 2020(06)
硕士论文
[1]I-B-Svi型CRISPR-Cas3系统在哺乳动物细胞中的基因编辑[D]. 唐严严.安徽大学 2019
[2]I-B-Svi型CRISPR-Cas系统在谷氨酸棒状杆菌中的基因编辑[D]. 夏婷婷.安徽大学 2019
[3]酿酒酵母合成番茄红素的途径优化研究[D]. 李霞.石河子大学 2018
[4]维吉尼亚链霉菌IBL14中sviscsn基因簇功能分析[D]. 许鑫.安徽大学 2017
[5]维吉尼亚链霉菌IBL14中I-B-svi型CRISPR-Cas系统及青霉素代谢相关酶基因自敲除[D]. 邱彩花.安徽大学 2017
[6]维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统及其基因编辑方法[D]. 雍德祥.安徽大学 2016
本文编号：3434997
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