取食双链RNA对山楂叶螨的基因干扰和沉默效率研究

发布时间：2021-10-17 08:06

　　山楂叶螨（Amphitetranychus viennensis）是我国果树重要叶面害虫,由于长期大量使用化学杀螨剂而产生了严重的抗药性问题。因此,急需寻找新的防治方法。RNA干扰（RNAi）技术作为新兴的生物技术,逐渐在害虫防治领域得到应用。但是要将这一技术应用于山楂叶螨的防治,首先要获得RNAi的靶标基因并检测干扰效率。本文对山楂叶螨进行了转录组测序,共得到10 GB Clean Data,34,631条Unigene,其中20,398个得到功能注释;数据质量经过单碱基质量、Base content分布、GC content分布和Sequence base quality四个指标评定,表明测序结果良好。通过对转录组学数据库的深入分析,获得高通量的潜在靶标基因。在山楂叶螨转录组数据中搜索后获得山楂叶螨ATPase A基因序列。利用PCR扩增获得编码山楂叶螨V-ATPase A的基因片段。以这一持家基因为靶标,验证山楂叶螨RNAi方法的可行性。本研究共尝试了3种山楂叶螨RNAi方法:叶柄吸收法、叶片吸收法和烘干叶片吸收法。结果表明烘干叶片吸收法效果最佳。随后我们在山楂叶螨转录组数据中获... 

【文章来源】：山西大学山西省

【文章页数】：70 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图2.1分析流程

第三章山楂叶螨RNAi方法建立25图3.1三种喂食山楂叶螨dsRNA的方法Fig.3.1ThreemethodsoffeedingdsRNAforA.viennensis注：A：方法一Method1;B：方法二Method2;C：方法三Method33.3.2沉默效率检测每个处理组取20头山楂叶螨提取总RNA，反转录合成cDNA，方法同3.1.2。用实时定量PCR检测目标基因表达量的变化，反应体系如下：表3.8RT-qPCR反应体系Tab.3.8RT-qPCRreactionsystem2×SYBRGreen10μl10μM正向引物0.32μl10μM反向引物0.32μlcDNA模板1.6μlddH2O7.76μlTotal20μl以上体系所使用的引物见表3.5，以GAPDH为内参基因，荧光定量PCR程序：95℃30s；95℃5s，60℃31s，循环数为40；95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。程序结束后导出数据，采用2-△△CT法计算其相对表达量，并对实验数值差异显著性分析。3.4实验结果与分析3.4.1山楂叶螨AvATPaseA基因片段克隆在转录组数据中获得山楂叶螨AvATPase基因cDNA以后，找到其1866bp长度的开放阅读框。用Primer5.0软件在开放阅读框中设计用于合成dsRNA基因片段的引物和RT-qPCR引物。PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳检测目的条带（图3.2），将所得片段与T载体连接，得到含有目的基因的克隆载体。

取食双链RNA对山楂叶螨的基因干扰和沉默效率研究26图3.2山楂叶螨AvATPaseA基因片段的PCR扩增Fig.3.2ThePCRamplificationofAvATPaseAgenefragmentfromA.viennensis注：M：DL5000DNAmarker；1：AvATPaseA的扩增产物CloningofAvATPaseA3.4.2山楂叶螨不同喂食方法的沉默效率对山楂叶螨dsRNA处理后，收集不同处理组的山楂叶螨样本，提取总RNA并反转录，将cDNA稀释20倍作为模板进行实时荧光定量。RT-qPCR分析结果显示，3种方法对AvATPaseA的沉默效率如图所示（图3.3）。


本文编号：3441424