利用杆状病毒实现外源基因在哺乳动物细胞内表达

发布时间：2021-10-30 03:16

　　杆状病毒是一类专职感染无脊椎动物的病毒,目前表达载体和基因转导载体广泛应用于科学研究和生物医药领域。研究在杆状病毒Bac-to-Bac操作系统基础上将杆状病毒载体改造成能在哺乳动物细胞内表达外源基因的载体。首先,将Bac-to-Bac操作系统中pFastBac-Dual质粒中的PH和p10启动子替换成巨细胞病毒（CMV）启动子和真核生物延伸因子（EF1）基因的启动子;然后将egfp基因和mCherry基因分别插入到EFI启动子和CMV启动子下游;通过转座获得表达egfp和mCherry基因的重组杆状病毒基因组,并转染Sf9细胞获得重组杆状病毒。重组杆状病毒可以在昆虫细胞和哺乳动物细胞内产生绿色荧光和红色荧光,表明以CMV启动子和EF1启动子构建的重组杆状病毒既可以在昆虫细胞内表达外源基因,又可以通过转导在哺乳动物细胞内表达外源基因。该载体可以应用于特殊蛋白的真核表达和基因治疗药物的研究开发。 

【文章来源】：湖北农业科学. 2020,59(23)

【文章页数】：6 页

【部分图文】：

Donor质粒构建流程

根据所设计的引物，扩增出来的片段PCMV和PEF1大小分别位于250～500 bp和500～750 bp，与片段预期的大小（分别为375和574 bp）相符。再通过Overlapping PCR将PCMV和PEF1融合在一起获得大小为750～1 000 bp的片段PCMV-PEF1（图2A），大小与预期大小（946 bp）相符。将PCMV-PEF1插入到p FastBac-Dual质粒的Xho I和Eco R I酶切位点后，获得改造的donor质粒p Fast Bac-2EP，质粒PCR鉴定和酶切鉴定结果（图2B和图2C）均表明质粒构建正确。进一步将质粒交由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，结果表明插入片段没有发生点突变。因此该donor质粒可用于下游试验。2.2 质粒p Fast Bac-2EP-m Cherry-egfp的构建

根据所设计引物扩增m Cherry和egfp基因，经琼脂糖凝胶电泳得到711和729 bp的两条条带（图3A），条带大小与预期相符。将目的片段m Cherry和egfp片段通过酶切连接的方法分别插入PCMV和PEF1下游，构建重组质粒。用限制性内切酶Xho I和Sph I以及Eco R I和Xba I分别对重组质粒进行酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析，表明酶切样品均能产生2条条带（图3B），大小与预期结果相符合。将鉴定正确的质粒交由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，结果显示插入序列没有发生突变，表明p Fast Bac-2EP-m Cherry-egfp构建成功。2.3 重组质粒p Ac-2EP-m Cherry-egfp的构建

【参考文献】：
期刊论文
[1]利用昆虫细胞杆状病毒表达载体系统研制疫苗的研究进展[J]. 思越,朱一超,宋曦玉,罗亚妮,程林峰.  热带医学杂志. 2020(08)
[2]Improving Baculovirus Transduction of Mammalian Cells by Incorporation of Thogotovirus Glycoproteins[J]. Liangbo Hu,Yimeng Li,Fei Deng,Zhihong Hu,Hualin Wang,Manli Wang.  Virologica Sinica. 2019(04)



本文编号：3465940