神农香菊萜类物质合成关键基因CiDXR的功能鉴定及启动子活性分析
发布时间：2021-10-30 08:47
神农香菊（Chrysanthemum indicum var.aroma）ticum是菊科（Compositae）菊属（Chrysanthemum）的多年生草本植物,植株香气浓郁,分泌物主要化学成分为龙脑、α-侧柏酮、β-侧柏酮等萜类化合物,是一种珍贵的香料植物。DXR基因是萜类物质合成MEP途径的一个关键的限速酶,对下游MEP的合成具有重要影响。为探究并完善神农香菊萜类物质合成通路关键酶基因的表达方式,本研究以神农香菊为实验材料,预测并分析了其萜类物质合成通路的关键酶基因,克隆并分析了神农香菊萜类合酶（CiDXR）基因及其启动子。研究结果如下:在经过茉莉酸甲酯处理后的神农香菊转录组数据中,共筛选到21个上调表达的萜类物质合成通路基因,未发现下调表达的基因。GO生物学过程注释到的主要集中在氧化还原过程、代谢过程、裂解酶、解旋酶和萜烯合酶活性生物过程中。在经过UV-B紫外光处理后的神农香菊转录组中,共发现68个差异表达基因,上调表达的片段共有36个,下调表达的基因片段有32个。GO生物过程注释主要集中在氧化还原过程、代谢过程和催化活性中。有6个基因被注释到萜类合酶活性过程。从神农香菊叶片...
【文章来源】：东北林业大学黑龙江省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２－２?ＧＯ生物过程注释富集分析??Ｆｉｇ．２－２?Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ＧＯ?ｂｉｏｌｏｇｉｃ?ｐｒｏｃｅｓｓ?ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ??
?２基于转录组数据的神农香菊萜类物质合酶分析???Ｃ?１９５８８．８０２６９?－１．８３?１？１６?Ｓ?叶绿体?Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ?ｒＲＮＡ修饰，氧化还原过程，代谢??ａｎｎｕｕｓ?过程，ｒＲＮＡ加工，甲基化，ＲＮＡ??加工，氧化还原酶活性，ｒＲＮＡ甲??基转移酶活性，甲基转移酶活性，??０－甲基转移酶活性??Ｃ１９５８８．５１２５２?－３．００?１３９２?否?胞外基质?Ｓｏｌａｎｕｍ?异戊二烯转移酶活性??ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ??Ｃ１９５８８．８６２５２?－１．４５?１４３３?是?叶绿体?Ｈｅｌｉａｎｔｆｍｓ?甲基化，甲基转移酶活性??ａｎｎｕｕｓ??基５０「??？??叙?ｍｍ??Ｉ?ｉ??１＂?Ｊ?「；??丨丨■?■?＿「……ｒ，??图２－４?ＧＯ生物过程注释富集分析??Ｆｉｇ．２－４?Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ＧＯ?ｂｉｏｌｏｇｉｃ?ｐｒｏｃｅｓｓ?ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ??－１７－??
ｌｅｒ？９６?（瑞士）的９６孔板中，设计ｑＲＴ－ＰＣＲ的反应程??序为：??９５°Ｃ?２?ｍｉｎ??９４°Ｃ?３０?ｓ?１??６０°Ｃ?１５?ｓ?＞?４０?ｃｙｃｌｅｓ??７２°Ｃ?１０ｓ??３７°Ｃ?３０ｓ??使用２－ａａＣＴ法计算基因的表达丰富度，不同部位的表达量的计算以根中表达量记为??１，茉莉酸甲酯处理下的基因表达量以未经处理的植物叶片中的表达量为１。??３．３结果与分析??３．３．１?ＣＶＤＡＴ？基因ＯＲＦ的克隆与序列分析??神农香菊叶片总ＲＮＡ?（图３－１）的电泳图片表明，５ｓ、１８ｓ和２８ｓ的三条核糖体带??清晰，说明提取出来的ＲＮＡ具有良好的完整性，无降解现象，可以用于下一步的反转??录和基因克隆实验。??图３－１神农香菊叶片ＲＮＡ电泳图??Ｆｉｇ．?３－１?Ｑｕａｎｔｉｔｙ?ｏｆ?ｅｘｔｒａｃｔｅｄ?ｔｏｔａｌ?ＲＮＡ?ｏｆ?Ｃ．?ｉｎｄｉｃｕｍ?ａｒｏｍａｔｉｃｕｍ??利用设计好的特异性引物ＣｉＤＸＲ－Ｆ／ＣｉＤＸＲ－Ｒ，以神农香菊总ＲＮＡ反转录获得的??ｃＤＮＡ为模板，利用ＰＣＲ扩增获得目的片段（图３－２），可以看出最明亮的条带在??１５００ｂｐ附近，和前期转录组数据中所预测的长度相近。将剩余ＰＣＲ产物进行胶回收，??连接ｐＵＣ－Ｔ载体，转入￡?Ｃ〇／／ＤＨ５ａ感受态细胞中，将转化好的菌液涂在含有５０ｍｇ／Ｌ??的Ａｍｐ的ＬＢ抗性培养基中，在３７?°Ｃ下恒温培养１２ｈ－１６ｈ。通过ＰＣＲ扩增筛选出１０??个阳性克隆（图３－３），选取３个最亮的条带进行测序。测序结果显示：开放阅读框??（ＯＲＦ）的长度为１４１９ｂｐ，编码４７２个氨基酸的多肽链（图３－４），该序列具有３个保??守
【参考文献】：
期刊论文
[1]黄花蒿HMGR启动子活性表达及核心序列分析[J]. 龙金花,向奕,肖文军,刘硕谦. 中草药. 2016(19)
[2]枇杷DXR基因的克隆及其在果实成熟过程中的表达分析[J]. 张玲,林顺权,胡又厘,郑婷婷,杨向晖. 果树学报. 2013(04)
[3]过量表达DXR基因提高青蒿中青蒿素的含量[J]. 陈韵斐,张芳源,唐克轩. 上海交通大学学报(农业科学版). 2012(05)
[4]油茶乙酰CoA酰基转移酶基因cDNA克隆及序列特征分析[J]. 张琳,谭晓风,胡姣,姚小华,林萍. 中南林业科技大学学报. 2011(08)
[5]种子特异性启动子的研究进展[J]. 李吉涛,郭建春. 安徽农业科学. 2008(04)
[6]植物萜类代谢工程[J]. 韩军丽,李振秋,刘本叶,王红,李国凤,叶和春. 生物工程学报. 2007(04)
[7]植物基因启动子的类型及其应用[J]. 胡廷章,罗凯,甘丽萍,石汝杰. 湖北农业科学. 2007(01)
[8]启动子的克隆和研究方法[J]. 况守龙,胡廷章. 重庆工学院学报(自然科学版). 2007(01)
[9]植物类萜生物合成途径及关键酶的研究进展[J]. 马靓,丁鹏,杨广笑,何光源. 生物技术通报. 2006(S1)
[10]茉莉酸甲酯:一种重要的植物信号转导分子[J]. 薛仁镐,金圣爱. 生物技术通讯. 2006(06)
博士论文
[1]苹果HMGR基因家族启动子的克隆及功能分析[D]. 吕东梅.山东农业大学 2016
硕士论文
[1]盐穗木转录因子HcSCL13启动子活性及盐响应调控机制的初探[D]. 冯肖莉.新疆大学 2019
[2]HMGR与DXR基因过表达对雷公藤萜类物质生物合成的影响[D]. 郭嘉.西北农林科技大学 2015
[3]山核桃CcLFY基因启动子的克隆及功能分析[D]. 李峥.浙江农林大学 2012
本文编号：3466431
【文章来源】：东北林业大学黑龙江省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２－２?ＧＯ生物过程注释富集分析??Ｆｉｇ．２－２?Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ＧＯ?ｂｉｏｌｏｇｉｃ?ｐｒｏｃｅｓｓ?ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ??
?２基于转录组数据的神农香菊萜类物质合酶分析???Ｃ?１９５８８．８０２６９?－１．８３?１？１６?Ｓ?叶绿体?Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ?ｒＲＮＡ修饰，氧化还原过程，代谢??ａｎｎｕｕｓ?过程，ｒＲＮＡ加工，甲基化，ＲＮＡ??加工，氧化还原酶活性，ｒＲＮＡ甲??基转移酶活性，甲基转移酶活性，??０－甲基转移酶活性??Ｃ１９５８８．５１２５２?－３．００?１３９２?否?胞外基质?Ｓｏｌａｎｕｍ?异戊二烯转移酶活性??ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ??Ｃ１９５８８．８６２５２?－１．４５?１４３３?是?叶绿体?Ｈｅｌｉａｎｔｆｍｓ?甲基化，甲基转移酶活性??ａｎｎｕｕｓ??基５０「??？??叙?ｍｍ??Ｉ?ｉ??１＂?Ｊ?「；??丨丨■?■?＿「……ｒ，??图２－４?ＧＯ生物过程注释富集分析??Ｆｉｇ．２－４?Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ＧＯ?ｂｉｏｌｏｇｉｃ?ｐｒｏｃｅｓｓ?ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ??－１７－??
ｌｅｒ？９６?（瑞士）的９６孔板中，设计ｑＲＴ－ＰＣＲ的反应程??序为：??９５°Ｃ?２?ｍｉｎ??９４°Ｃ?３０?ｓ?１??６０°Ｃ?１５?ｓ?＞?４０?ｃｙｃｌｅｓ??７２°Ｃ?１０ｓ??３７°Ｃ?３０ｓ??使用２－ａａＣＴ法计算基因的表达丰富度，不同部位的表达量的计算以根中表达量记为??１，茉莉酸甲酯处理下的基因表达量以未经处理的植物叶片中的表达量为１。??３．３结果与分析??３．３．１?ＣＶＤＡＴ？基因ＯＲＦ的克隆与序列分析??神农香菊叶片总ＲＮＡ?（图３－１）的电泳图片表明，５ｓ、１８ｓ和２８ｓ的三条核糖体带??清晰，说明提取出来的ＲＮＡ具有良好的完整性，无降解现象，可以用于下一步的反转??录和基因克隆实验。??图３－１神农香菊叶片ＲＮＡ电泳图??Ｆｉｇ．?３－１?Ｑｕａｎｔｉｔｙ?ｏｆ?ｅｘｔｒａｃｔｅｄ?ｔｏｔａｌ?ＲＮＡ?ｏｆ?Ｃ．?ｉｎｄｉｃｕｍ?ａｒｏｍａｔｉｃｕｍ??利用设计好的特异性引物ＣｉＤＸＲ－Ｆ／ＣｉＤＸＲ－Ｒ，以神农香菊总ＲＮＡ反转录获得的??ｃＤＮＡ为模板，利用ＰＣＲ扩增获得目的片段（图３－２），可以看出最明亮的条带在??１５００ｂｐ附近，和前期转录组数据中所预测的长度相近。将剩余ＰＣＲ产物进行胶回收，??连接ｐＵＣ－Ｔ载体，转入￡?Ｃ〇／／ＤＨ５ａ感受态细胞中，将转化好的菌液涂在含有５０ｍｇ／Ｌ??的Ａｍｐ的ＬＢ抗性培养基中，在３７?°Ｃ下恒温培养１２ｈ－１６ｈ。通过ＰＣＲ扩增筛选出１０??个阳性克隆（图３－３），选取３个最亮的条带进行测序。测序结果显示：开放阅读框??（ＯＲＦ）的长度为１４１９ｂｐ，编码４７２个氨基酸的多肽链（图３－４），该序列具有３个保??守
【参考文献】：
期刊论文
[1]黄花蒿HMGR启动子活性表达及核心序列分析[J]. 龙金花,向奕,肖文军,刘硕谦. 中草药. 2016(19)
[2]枇杷DXR基因的克隆及其在果实成熟过程中的表达分析[J]. 张玲,林顺权,胡又厘,郑婷婷,杨向晖. 果树学报. 2013(04)
[3]过量表达DXR基因提高青蒿中青蒿素的含量[J]. 陈韵斐,张芳源,唐克轩. 上海交通大学学报(农业科学版). 2012(05)
[4]油茶乙酰CoA酰基转移酶基因cDNA克隆及序列特征分析[J]. 张琳,谭晓风,胡姣,姚小华,林萍. 中南林业科技大学学报. 2011(08)
[5]种子特异性启动子的研究进展[J]. 李吉涛,郭建春. 安徽农业科学. 2008(04)
[6]植物萜类代谢工程[J]. 韩军丽,李振秋,刘本叶,王红,李国凤,叶和春. 生物工程学报. 2007(04)
[7]植物基因启动子的类型及其应用[J]. 胡廷章,罗凯,甘丽萍,石汝杰. 湖北农业科学. 2007(01)
[8]启动子的克隆和研究方法[J]. 况守龙,胡廷章. 重庆工学院学报(自然科学版). 2007(01)
[9]植物类萜生物合成途径及关键酶的研究进展[J]. 马靓,丁鹏,杨广笑,何光源. 生物技术通报. 2006(S1)
[10]茉莉酸甲酯:一种重要的植物信号转导分子[J]. 薛仁镐,金圣爱. 生物技术通讯. 2006(06)
博士论文
[1]苹果HMGR基因家族启动子的克隆及功能分析[D]. 吕东梅.山东农业大学 2016
硕士论文
[1]盐穗木转录因子HcSCL13启动子活性及盐响应调控机制的初探[D]. 冯肖莉.新疆大学 2019
[2]HMGR与DXR基因过表达对雷公藤萜类物质生物合成的影响[D]. 郭嘉.西北农林科技大学 2015
[3]山核桃CcLFY基因启动子的克隆及功能分析[D]. 李峥.浙江农林大学 2012
本文编号：3466431
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3466431.html
最近更新
教材专著
