托品烷生物碱生物合成途径中三个新基因的发现与功能鉴定
发布时间：2021-10-30 10:39
天然产物（Natural Products）是药物的重要来源,在治疗疾病、维护健康和改善生活质量等方面起到十分重要的作用。托品烷生物碱（Tropane Alkaloids,TAs）是一类具有独特托品烷骨架（Tropane Skeleton）的生物碱。莨菪碱（Hyoscyamine）和东莨菪碱（Scopolamine）是TAs中最具代表性的药物,在临床上作为抗胆碱药物用于麻醉镇痛、止咳平喘、治疗晕动症和农药中毒等。茄科药用植物如颠茄（Atropa belladonna）、曼陀罗（Datura species）和澳洲毒茄杂交种（Dubiosia×hybrid）是生产TAs的主要来源。颠茄为国内外多部药典收录且大规模人工种植,是最为重要的生产TAs的药用植物。颠茄叶片中TAs含量很低,莨菪碱含量一般为0.2%干重（Dry Weight,DW）,东莨菪碱含量一般为0.02%DW。莨菪碱和东莨菪碱的市场需求巨大,来源十分有限,导致其药物资源短缺。代谢工程技术和合成生物学技术被认为是解决药物资源短缺问题最为有效的方法,但是代谢工程和合成生物学都依赖于鉴定生物合成途径中的基因/酶。迄今为止,共有9个...
【文章来源】：西南大学重庆市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：141 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
托品环骨架、莨菪碱和东莨菪碱分子结构
西南大学博士学位论文4`r图1-2.TAs生物合成途径实线箭头表示已鉴定的反应，虚线表示未知反应或多步反应。Figure1-2.BiosyntheticpathwayoftropanealkaloidsSolidarrowsindicateidentifiedreactions,dashedlinesrepresentedunknownormultistepreactions.1.2.1鸟氨酸脱羧酶鸟氨酸是TAs生物合成的基本前体，其脱羧产物腐胺是多胺、TAs和尼古丁的共同前体[59]。二氟甲基鸟氨酸（Difluoromethylornithine，DFMO）是鸟氨酸脱羧酶（OrnithineDecarboxylase，ODC）的专一抑制剂，用其处理天仙子和颠茄等植物材料，能够大幅度减少莨菪碱的生物合成，表明ODC参与TAs的生物合成[60]。ODC属于磷酸吡哆醛依赖的氨基酸脱羧酶家族，能够以鸟氨酸作为底物，直接脱羧形成腐胺[61]。由于ODC参与多胺和尼古丁生物合成，其相关研究大多集中在于植物抗逆性和尼古丁生物合成方面[62]。在关于ODC参与TAs生物研究方面，Michael等从草本曼陀罗中克隆了ODC基因，发现该基因在侧根中高表达，将该基因在大肠杆菌中表达，能够检测到较高的鸟氨酸脱羧活性；但由于没有纯化重组蛋白，关于该酶的相关动力学研究并不清楚[63]。Zhao等从天仙子中克隆了ODC基因（HnODC），并开展了酶动力学研究，表明HnODC能够高效率催化鸟氨酸脱羧生成腐胺[64]。赵腾飞对颠茄ODC（AbODC）进行了较为系统的
西南大学博士学位论文40图3-1.hmmsearch筛选获得的羟酸脱氢酶基因和报道的TAs生物合成途径基因在颠茄不同组织中的表达相关性分析红线框表示报道的TAs生物合成途径基因和具有根特异性表达的候选基因。Figure3-1.CorrelationanalysisoftheexpressionofhydroxylaciddehydrogenasesgenesbyhmmsearchandTAsbiosyntheticpathwaygenesindifferenttissuesofA.belladonnaTheredboxrepresentedtheidentifiedTAsbiosyntheticpathwaygenesandcandidategeneswithroot-specificexpression.3.2.2克隆颠茄PPR的cDNA序列将上述登录号为aba_locus_14073的unigene命名为苯丙酮酸还原酶基因（PPR）。采用RACE技术获得了471bp长度的3′末端和461bp长度的5′末端，利用VectorNTI11.5将转录组序列和RACE获得的3′和5′末端序列进行拼接，获得了PPR基因电子序列；高保真DNA聚合酶扩增获得PPR基因的物理序列。颠茄PPR的cDNA序列为1445bp，包含7bp的5′UTR、1029bp的ORF和408bp的3′UTR，该基因编码342个氨基酸的多肽，预测其分子量为38.4kDa，等电点为6.09（图3-2）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]植物天然产物与合成生物学[J]. 罗杰,王勇,郑亚洁,黄继荣. 植物生理学报. 2017(08)
[2]天仙子中参与托品烷生物碱生物合成的ArAT基因的克隆及功能鉴定[J]. 李笑,强玮,邱飞,陈敏,兰小中,廖志华,刘小强. 药学学报. 2017(01)
[3]托品烷生物碱生物合成与代谢工程研究进展[J]. 强玮,范雨芳,廖志华. 世界科学技术-中医药现代化. 2016(11)
[4]木本曼陀罗中催化东莨菪碱生物合成关键步骤的H6H基因克隆与表达分析[J]. 强玮,侯艳玲,李笑,夏科,廖志华. 药学学报. 2015(10)
[5]植物次生代谢产物生物反应器研究进展[J]. 唐克轩,沈乾,付雪晴,颜廷祥. 中国农业科技导报. 2014(01)
[6]颠茄托品烷生物碱合成途径基因表达分析与生物碱积累研究[J]. 强玮,王亚雄,张巧卓,李金弟,夏科,吴能表,廖志华. 中国中药杂志. 2014(01)
[7]过表达莨菪h6h基因提高颠茄东莨菪碱含量的研究[J]. 李金弟,秦白富,杨春贤,兰小中,吴能表,廖志华. 中国中药杂志. 2013(11)
[8]药用植物次生代谢工程研究概况[J]. 生书晶,赵炜,赵树进. 生命的化学. 2010(06)
[9]麻醉学过去现在与未来[J]. 姚尚龙. 皖南医学院学报. 2009(01)
博士论文
[1]颠茄N-甲基腐胺氧化酶基因的克隆与功能研究[D]. Zun Lai Lai Htun.西南大学 2019
本文编号：3466582
【文章来源】：西南大学重庆市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：141 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
托品环骨架、莨菪碱和东莨菪碱分子结构
西南大学博士学位论文4`r图1-2.TAs生物合成途径实线箭头表示已鉴定的反应，虚线表示未知反应或多步反应。Figure1-2.BiosyntheticpathwayoftropanealkaloidsSolidarrowsindicateidentifiedreactions,dashedlinesrepresentedunknownormultistepreactions.1.2.1鸟氨酸脱羧酶鸟氨酸是TAs生物合成的基本前体，其脱羧产物腐胺是多胺、TAs和尼古丁的共同前体[59]。二氟甲基鸟氨酸（Difluoromethylornithine，DFMO）是鸟氨酸脱羧酶（OrnithineDecarboxylase，ODC）的专一抑制剂，用其处理天仙子和颠茄等植物材料，能够大幅度减少莨菪碱的生物合成，表明ODC参与TAs的生物合成[60]。ODC属于磷酸吡哆醛依赖的氨基酸脱羧酶家族，能够以鸟氨酸作为底物，直接脱羧形成腐胺[61]。由于ODC参与多胺和尼古丁生物合成，其相关研究大多集中在于植物抗逆性和尼古丁生物合成方面[62]。在关于ODC参与TAs生物研究方面，Michael等从草本曼陀罗中克隆了ODC基因，发现该基因在侧根中高表达，将该基因在大肠杆菌中表达，能够检测到较高的鸟氨酸脱羧活性；但由于没有纯化重组蛋白，关于该酶的相关动力学研究并不清楚[63]。Zhao等从天仙子中克隆了ODC基因（HnODC），并开展了酶动力学研究，表明HnODC能够高效率催化鸟氨酸脱羧生成腐胺[64]。赵腾飞对颠茄ODC（AbODC）进行了较为系统的
西南大学博士学位论文40图3-1.hmmsearch筛选获得的羟酸脱氢酶基因和报道的TAs生物合成途径基因在颠茄不同组织中的表达相关性分析红线框表示报道的TAs生物合成途径基因和具有根特异性表达的候选基因。Figure3-1.CorrelationanalysisoftheexpressionofhydroxylaciddehydrogenasesgenesbyhmmsearchandTAsbiosyntheticpathwaygenesindifferenttissuesofA.belladonnaTheredboxrepresentedtheidentifiedTAsbiosyntheticpathwaygenesandcandidategeneswithroot-specificexpression.3.2.2克隆颠茄PPR的cDNA序列将上述登录号为aba_locus_14073的unigene命名为苯丙酮酸还原酶基因（PPR）。采用RACE技术获得了471bp长度的3′末端和461bp长度的5′末端，利用VectorNTI11.5将转录组序列和RACE获得的3′和5′末端序列进行拼接，获得了PPR基因电子序列；高保真DNA聚合酶扩增获得PPR基因的物理序列。颠茄PPR的cDNA序列为1445bp，包含7bp的5′UTR、1029bp的ORF和408bp的3′UTR，该基因编码342个氨基酸的多肽，预测其分子量为38.4kDa，等电点为6.09（图3-2）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]植物天然产物与合成生物学[J]. 罗杰,王勇,郑亚洁,黄继荣. 植物生理学报. 2017(08)
[2]天仙子中参与托品烷生物碱生物合成的ArAT基因的克隆及功能鉴定[J]. 李笑,强玮,邱飞,陈敏,兰小中,廖志华,刘小强. 药学学报. 2017(01)
[3]托品烷生物碱生物合成与代谢工程研究进展[J]. 强玮,范雨芳,廖志华. 世界科学技术-中医药现代化. 2016(11)
[4]木本曼陀罗中催化东莨菪碱生物合成关键步骤的H6H基因克隆与表达分析[J]. 强玮,侯艳玲,李笑,夏科,廖志华. 药学学报. 2015(10)
[5]植物次生代谢产物生物反应器研究进展[J]. 唐克轩,沈乾,付雪晴,颜廷祥. 中国农业科技导报. 2014(01)
[6]颠茄托品烷生物碱合成途径基因表达分析与生物碱积累研究[J]. 强玮,王亚雄,张巧卓,李金弟,夏科,吴能表,廖志华. 中国中药杂志. 2014(01)
[7]过表达莨菪h6h基因提高颠茄东莨菪碱含量的研究[J]. 李金弟,秦白富,杨春贤,兰小中,吴能表,廖志华. 中国中药杂志. 2013(11)
[8]药用植物次生代谢工程研究概况[J]. 生书晶,赵炜,赵树进. 生命的化学. 2010(06)
[9]麻醉学过去现在与未来[J]. 姚尚龙. 皖南医学院学报. 2009(01)
博士论文
[1]颠茄N-甲基腐胺氧化酶基因的克隆与功能研究[D]. Zun Lai Lai Htun.西南大学 2019
本文编号：3466582
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