产木聚糖酶嗜热真菌鉴定基因克隆及米曲霉表达系统构建
发布时间：2021-11-01 01:48
木聚糖酶是一类木聚糖降解酶系,在食品、饲料领域应用广泛。但目前该酶的应用受到酶活低、热稳定性差、不安全等因素的制约。本文通过将食品级米曲霉系统和产木聚糖酶嗜热菌株有机结合起来,为木聚糖酶基因工程方法获得酶活高、工业成本低、安全的木聚糖酶研究提供新的思路奠定基础。主要实验结果如下:（1）对实验室前期保存的一株产木聚糖酶真菌TL01进行形态学、18S rDNA及产酶鉴定,其结果表明TL01为梳棉状嗜热真菌,测得粗酶活为0.250?0.03 U/mL;对其两种主要的木聚糖酶基因（xyn11A和xyl43）进行克隆和分子生物学分析。xyn11A预测蛋白分子量24.36 kDa,等电点为4.77,含有19个氨基酸的信号肽序列,属于亲水性蛋白,无跨膜结构域,其二级结构主要是无规则卷曲（44.89%）;xyl43蛋白分子量38.24kDa,等电点为5.23,编码的胞内蛋白属于亲水性蛋白,无跨膜结构域,无规则卷曲（59.76%）是其主要的二级结构。（2）通过紫外诱变技术并结合表型、测序验证得到一株pyrG营养缺陷型菌株RIB40△pyrG。将pyrG筛选标记、启动子及信号肽amyB、终止子amyBt、...
【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校
【文章页数】：100 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
木聚糖的结构和木聚糖降解酶的酶切位点(a):木聚糖主链；(b):β-木糖苷酶降解低聚木糖
3.1 形态学鉴定 设置不同温度进行真菌培养，发现真菌在 19℃不生长而 56℃生长，符合嗜热真菌生长特性，初步认为菌株 TL01 是嗜热真菌。根据真菌鉴定手册，本实验将菌株 TL01分别点接于马铃薯培养基、高氏 1 号培养基、察氏培养基、纤维素培养基及半纤维素培养基，并置于 50℃静置培养 3~4 d，其菌落生长情况见图 3.1A-E。该菌株在不同碳源培养基上的菌落形态基本一致，但产生色素情况差异很大，而且在高温时能够很快蔓延，在低温培养时几乎不生长，具体生长特征见表 3.1。通过显微镜观察，菌株 TL01 菌丝（图 3.1F）疏松，孢子为球形，有隔膜，表面出现褶皱。其结果表明该菌株为丝状真菌。
17表3.1不同碳源底物培养基中菌落生长状况Table3.1ColonyGrowthinDifferentCarbonSourceSubstrates不同碳源底物的培养基菌落生长情况菌落产色素情况菌落形态马铃薯培养基较好黄褐色菌落生长迅速，圆状凸出，菌落初期呈白色绒毛絮状，后期变为灰褐色，培养基背面变为黄色，菌落中心为黄褐色高氏1号培养基较差-------菌落早期为绒毛状菌丝，后期变为灰黑色，但菌落蔓延能力较差察氏培养基较差-------出现绒毛状白色菌丝，很少蔓延麦芽糖培养基较好灰黑色生长初期白色菌丝生长旺盛，后期出现中心颜色深，外沿颜色浅的同心圆淀粉培养基较好暗红色菌落迅速蔓延，圆形，枕状中凸，边缘整齐，菌落中间颜色较深。3.2分子生物学鉴定提取嗜热真菌TL01基因组DNA，对其ITS保守序列采用通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增，其结果如图3.2所示。扩增得到的ITS序列750bp左右，而真菌ITS区域长度一般在500~750bp，符合预期值。对扩增得到的ITS序列采用琼脂糖凝胶试剂盒纯化，并送公司测序。图3.2真菌TL01的ITS序列M:D2000;1:ITS序列Fig.3.2ITSsequencesoffungiTL01M:D2000;1:ITSsequence测得的序列在NCBI数据库中进行比对，选择相关序列，采用MEGA6.0软件的最
【参考文献】：
期刊论文
[1]木聚糖酶异源表达的研究进展[J]. 李吉萍,包昌杰,陈光,张斯童. 中国生物工程杂志. 2019(07)
[2]木聚糖酶在食品工业中的应用研究进展[J]. 高雅君,丁长河. 粮食与食品工业. 2017(02)
[3]木聚糖酶的研究进展[J]. 陈洪洋,蔡俊,林建国,王常高,杜馨. 中国酿造. 2016(11)
[4]香菇尿嘧啶营养缺陷型菌株的筛选与分子验证[J]. 王连会,茅文俊,鲍大鹏. 上海农业学报. 2014(03)
[5]木聚糖酶在猪日粮中的应用及其作用机理[J]. 冯定远. 饲料工业. 2013(06)
[6]东方肉座菌EU7-22木聚糖酶和木糖苷酶基因克隆及生物信息学研究[J]. 龙传南,蒋凤姣,邬小兵,刘健,龙敏南. 生物信息学. 2013(01)
[7]木聚糖酶对玉米、豆粕、小麦和菜粕体外消化率的影响[J]. 付大波,訾乃涛,熊晓燕,周樱. 饲料工业. 2013(04)
[8]多聚组氨酸融合标签在蛋白药物开发中的应用[J]. 阮建兵,梅艳珍. 生物技术通报. 2012(06)
[9]基于ITS序列对秦岭4种未知真菌进行分子鉴定[J]. 和晓娜,李书兰,李安利,李峻志,杨章民. 安徽农业科学. 2012(03)
[10]角毛壳菌β-1,4-内切木聚糖酶基因的生物信息学分析[J]. 张海燕,王伟,张珅. 科技信息. 2011(32)
硕士论文
[1]米曲霉营养缺陷型表达系统的构建及其在耐寒菌低温α-淀粉酶表达中的应用研究[D]. 毛佑志.华东理工大学 2015
[2]米曲霉表达系统的构建及其在产黄青霉α-淀粉酶表达中的应用[D]. 尹燕辰.华东理工大学 2015
[3]酱油工业菌株米曲霉3.951自克隆系统的构建[D]. 季艳伟.南昌大学 2012
[4]含有重组华根霉脂肪酶和转谷氨酰胺酶的冷冻面团抗冻性的研究[D]. 李珍妮.江南大学 2012
[5]复杂蛋白质样品中目标组分柱层析分离纯化策略研究[D]. 梁欣.西北大学 2009
[6]耐热木聚糖酶的体外分子进化及其生物信息学分析[D]. 连惠芗.福建农林大学 2009
[7]金属螯合亲和色谱填料的制备及其在六聚组氨酸融合蛋白分离中的应用[D]. 孙永亮.陕西师范大学 2007
本文编号：3469283
【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校
【文章页数】：100 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
木聚糖的结构和木聚糖降解酶的酶切位点(a):木聚糖主链；(b):β-木糖苷酶降解低聚木糖
3.1 形态学鉴定 设置不同温度进行真菌培养，发现真菌在 19℃不生长而 56℃生长，符合嗜热真菌生长特性，初步认为菌株 TL01 是嗜热真菌。根据真菌鉴定手册，本实验将菌株 TL01分别点接于马铃薯培养基、高氏 1 号培养基、察氏培养基、纤维素培养基及半纤维素培养基，并置于 50℃静置培养 3~4 d，其菌落生长情况见图 3.1A-E。该菌株在不同碳源培养基上的菌落形态基本一致，但产生色素情况差异很大，而且在高温时能够很快蔓延，在低温培养时几乎不生长，具体生长特征见表 3.1。通过显微镜观察，菌株 TL01 菌丝（图 3.1F）疏松，孢子为球形，有隔膜，表面出现褶皱。其结果表明该菌株为丝状真菌。
17表3.1不同碳源底物培养基中菌落生长状况Table3.1ColonyGrowthinDifferentCarbonSourceSubstrates不同碳源底物的培养基菌落生长情况菌落产色素情况菌落形态马铃薯培养基较好黄褐色菌落生长迅速，圆状凸出，菌落初期呈白色绒毛絮状，后期变为灰褐色，培养基背面变为黄色，菌落中心为黄褐色高氏1号培养基较差-------菌落早期为绒毛状菌丝，后期变为灰黑色，但菌落蔓延能力较差察氏培养基较差-------出现绒毛状白色菌丝，很少蔓延麦芽糖培养基较好灰黑色生长初期白色菌丝生长旺盛，后期出现中心颜色深，外沿颜色浅的同心圆淀粉培养基较好暗红色菌落迅速蔓延，圆形，枕状中凸，边缘整齐，菌落中间颜色较深。3.2分子生物学鉴定提取嗜热真菌TL01基因组DNA，对其ITS保守序列采用通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增，其结果如图3.2所示。扩增得到的ITS序列750bp左右，而真菌ITS区域长度一般在500~750bp，符合预期值。对扩增得到的ITS序列采用琼脂糖凝胶试剂盒纯化，并送公司测序。图3.2真菌TL01的ITS序列M:D2000;1:ITS序列Fig.3.2ITSsequencesoffungiTL01M:D2000;1:ITSsequence测得的序列在NCBI数据库中进行比对，选择相关序列，采用MEGA6.0软件的最
【参考文献】：
期刊论文
[1]木聚糖酶异源表达的研究进展[J]. 李吉萍,包昌杰,陈光,张斯童. 中国生物工程杂志. 2019(07)
[2]木聚糖酶在食品工业中的应用研究进展[J]. 高雅君,丁长河. 粮食与食品工业. 2017(02)
[3]木聚糖酶的研究进展[J]. 陈洪洋,蔡俊,林建国,王常高,杜馨. 中国酿造. 2016(11)
[4]香菇尿嘧啶营养缺陷型菌株的筛选与分子验证[J]. 王连会,茅文俊,鲍大鹏. 上海农业学报. 2014(03)
[5]木聚糖酶在猪日粮中的应用及其作用机理[J]. 冯定远. 饲料工业. 2013(06)
[6]东方肉座菌EU7-22木聚糖酶和木糖苷酶基因克隆及生物信息学研究[J]. 龙传南,蒋凤姣,邬小兵,刘健,龙敏南. 生物信息学. 2013(01)
[7]木聚糖酶对玉米、豆粕、小麦和菜粕体外消化率的影响[J]. 付大波,訾乃涛,熊晓燕,周樱. 饲料工业. 2013(04)
[8]多聚组氨酸融合标签在蛋白药物开发中的应用[J]. 阮建兵,梅艳珍. 生物技术通报. 2012(06)
[9]基于ITS序列对秦岭4种未知真菌进行分子鉴定[J]. 和晓娜,李书兰,李安利,李峻志,杨章民. 安徽农业科学. 2012(03)
[10]角毛壳菌β-1,4-内切木聚糖酶基因的生物信息学分析[J]. 张海燕,王伟,张珅. 科技信息. 2011(32)
硕士论文
[1]米曲霉营养缺陷型表达系统的构建及其在耐寒菌低温α-淀粉酶表达中的应用研究[D]. 毛佑志.华东理工大学 2015
[2]米曲霉表达系统的构建及其在产黄青霉α-淀粉酶表达中的应用[D]. 尹燕辰.华东理工大学 2015
[3]酱油工业菌株米曲霉3.951自克隆系统的构建[D]. 季艳伟.南昌大学 2012
[4]含有重组华根霉脂肪酶和转谷氨酰胺酶的冷冻面团抗冻性的研究[D]. 李珍妮.江南大学 2012
[5]复杂蛋白质样品中目标组分柱层析分离纯化策略研究[D]. 梁欣.西北大学 2009
[6]耐热木聚糖酶的体外分子进化及其生物信息学分析[D]. 连惠芗.福建农林大学 2009
[7]金属螯合亲和色谱填料的制备及其在六聚组氨酸融合蛋白分离中的应用[D]. 孙永亮.陕西师范大学 2007
本文编号：3469283
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