利用CRISPR/Cas9技术编辑青鳉tyr和nanog基因
发布时间：2021-11-02 07:50
CRISPR/Cas9是一种来源于细菌获得性免疫系统,经人工改造后可对靶基因进行修饰的技术,具有构建方法简单、效率高、成本低、使用范围广等优点。目前,该技术已经成功应用于细菌以及多种动植物的基因组精确修饰中,是最具有临床应用前景的基因编辑技术。Nanog基因作为诱导多能性干细胞关键因子之一,对胚胎早期发育和维持胚胎干细胞全能性具有重要的作用。本实验以青鳉为研究对象,通过使用斑马鱼密码子优化的Cas9编码序列,对青鳉tyr和nanog基因进行基因编辑。实验结果表明斑马鱼密码子优化的CRISPR/Cas9系统可以高效率敲除青鳉tyr和nanog基因,而且通过同源重组机制也可以介导青鳉nanog基因敲入。总而言之,青鳉CRISPR/Cas9基因编辑技术体系的建立为研究青鳉nanog基因功能奠定重要的基础。主要研究结果如下:（1）使用CRISPR/Cas9系统,采用单靶点方式敲除青鳉tyr基因。在F0代可以观察到眼睛部位有明显的色素缺失,并通过连续自交和表型筛选的方式快速获得了能够稳定遗传的青鳉白化品系。（2）使用CRISPR/Cas9系统,采用双靶点敲除方式敲除青鳉nanog基因,测序结果表...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：90 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
青鳉胚胎显微注射琼脂糖预制凹槽模具
图 2-2 青鳉胚胎显微注射琼脂糖凹槽示意图Fig. 2-2 Schematic of agarose plates for medaka embryos microinjection（A）制作 1.5%琼脂糖模具；（B）模具成型(A) Making the 1.5% mould; (B) Mould making completed青鳉显微注射针制备胚胎绒毛膜比较厚、硬，不容易扎破。在进行显微注射时对显高，需要针尖小且受力大，与常用的斑马鱼注射针相比差异较大青鳉胚胎的特点使用外径 1 mm、内径 0.58 mm 的毛细玻璃管度陡的青鳉显微注射针（图 2-3），以满足实验需求。
图 2-3 青鳉和斑马鱼注射针的比较Fig. 2-3 Comparison of medaka and zebrafish needles2.2.1.3 青鳉显微注射样品配制显微注射技术可以将 DNA、RNA 或染料样品注射到胚胎中。由于青鳉胚不能像斑马鱼胚胎那样可以将注射到卵黄中的 DNA 或 RNA 转运到细胞核中因此青鳉胚胎显微注射时需要将 DNA 或 RNA 样品注射到 1~2 细胞期胚胎的胞中。在配制显微注射样品时通常会加入终浓度为 0.2%的酚红作为指示剂，便注射时观察样品注射的部位及剂量。2.2.1.4 青鳉显微注射注射前天晚上将野生型青鳉按雌：雄=1：1 比例配对并用隔板隔开，次日微注射前 30 min 左右抽出隔板使其自然产卵，20 min 后收集胚胎并用镊子去胚胎表面的黏丝清洗干净后待用。利用 Picoliter Microinjector 注射仪将实验样
【参考文献】：
期刊论文
[1]两种密码子优化的Cas9编码基因在斑马鱼胚胎中基因敲除效率的比较[J]. 张峰华,王厚鹏,黄思雨,熊凤,朱作言,孙永华. 遗传. 2016(02)
[2]青鳉的生物学特性与饲养管理技术[J]. 黄玉瑶. 动物学杂志. 1988(06)
本文编号：3471632
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：90 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
青鳉胚胎显微注射琼脂糖预制凹槽模具
图 2-2 青鳉胚胎显微注射琼脂糖凹槽示意图Fig. 2-2 Schematic of agarose plates for medaka embryos microinjection（A）制作 1.5%琼脂糖模具；（B）模具成型(A) Making the 1.5% mould; (B) Mould making completed青鳉显微注射针制备胚胎绒毛膜比较厚、硬，不容易扎破。在进行显微注射时对显高，需要针尖小且受力大，与常用的斑马鱼注射针相比差异较大青鳉胚胎的特点使用外径 1 mm、内径 0.58 mm 的毛细玻璃管度陡的青鳉显微注射针（图 2-3），以满足实验需求。
图 2-3 青鳉和斑马鱼注射针的比较Fig. 2-3 Comparison of medaka and zebrafish needles2.2.1.3 青鳉显微注射样品配制显微注射技术可以将 DNA、RNA 或染料样品注射到胚胎中。由于青鳉胚不能像斑马鱼胚胎那样可以将注射到卵黄中的 DNA 或 RNA 转运到细胞核中因此青鳉胚胎显微注射时需要将 DNA 或 RNA 样品注射到 1~2 细胞期胚胎的胞中。在配制显微注射样品时通常会加入终浓度为 0.2%的酚红作为指示剂，便注射时观察样品注射的部位及剂量。2.2.1.4 青鳉显微注射注射前天晚上将野生型青鳉按雌：雄=1：1 比例配对并用隔板隔开，次日微注射前 30 min 左右抽出隔板使其自然产卵，20 min 后收集胚胎并用镊子去胚胎表面的黏丝清洗干净后待用。利用 Picoliter Microinjector 注射仪将实验样
【参考文献】：
期刊论文
[1]两种密码子优化的Cas9编码基因在斑马鱼胚胎中基因敲除效率的比较[J]. 张峰华,王厚鹏,黄思雨,熊凤,朱作言,孙永华. 遗传. 2016(02)
[2]青鳉的生物学特性与饲养管理技术[J]. 黄玉瑶. 动物学杂志. 1988(06)
本文编号：3471632
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3471632.html
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