水牛NLRP5基因原核表达载体构建及多克隆抗体制备

发布时间：2021-11-02 09:00

　　为了制备水牛母源基因NLRP5多克隆抗体,采用PCR扩增水牛NLRP5基因并利用原核表达技术构建NLRP5表达载体,转化感受态细胞BL21,通过IPTG诱导表达,纯化后的重组蛋白用于免疫小鼠,制备鼠抗NLRP5多克隆抗体,用Western blot分析该基因在水牛各组织的表达特性。结果表明:通过PCR扩增成功克隆了水牛NLRP5基因CDS序列3 297 bp和原核表达的480 bp目的片段,成功构建了原核表达载体p ET32a-NLRP5。在诱导最佳条件（0.5 mmol/L IPTG,30℃诱导10 h）下NLRP5重组蛋白以包涵体形式表达,纯化复性后重组蛋白能和His标签特异性反应。用该重组蛋白免疫制备获取的鼠抗NLRP5多克隆抗体与NLRP5重组蛋白反应,效价达1∶64 000。用制备的多克隆抗体验证NLRP5蛋白,仅在水牛卵母细胞中特异性表达,其他组织中均无表达。 

【文章来源】：黑龙江动物繁殖. 2020,28(04)

【文章页数】：6 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 水牛组织、质粒与试验动物
    1.2 主要试剂
    1.3 试验步骤
        1.3.1 引物设计
        1.3.2 总RNA的提取与cDNA的合成
        1.3.3 PCR扩增
        1.3.4 水牛NLRP5基因序列的生物信息学分析
        1.3.5原核表达载体的构建
        1.3.6 重组蛋白的表达及纯化
        1.3.7 免疫程序及多克隆抗体制备
        1.3.8 鼠抗NLRP5多克隆抗体的鉴定
2 结果与分析
    2.1 水牛NLRP5基因克隆和生物信息学分析
    2.2 PET32a-NLRP5表达载体的构建与鉴定结果
    2.3 重组蛋白的诱导表达
    2.4 NLRP5重组蛋白的Western blot鉴定结果
    2.5 NLRP5多克隆抗体效价
    2.6 NLRP5在水牛卵母细胞和颗粒的表达
3 讨论
4 结论



本文编号：3471739