Scriptaid对APN基因编辑猪皮肤成纤维细胞体外生长及其再克隆胚胎发育的影响
发布时间：2021-11-03 05:33
体细胞核移植技术（Somatic cell nuclear transfer,SCNT）在创制基因修饰动物方面已展现出巨大的应用价值,是一种在家畜抗病育种材料创制、疾病模型构建和基础医学研究等方面具有广阔应用前景的技术。以转基因克隆动物的体细胞为核供体进行SCNT,开展再克隆以获得更多转基因动物已被证明是可行的。然而目前关于转基因猪再克隆的研究有限且再克隆效率也不理想。研究表明,利用组蛋白去乙酰化抑制剂Scriptaid处理非转基因供体细胞或SCNT重构胚胎可改善克隆胚胎发育。本实验室前期创建了抗猪传染性胃肠炎的APN基因编辑克隆猪。为建立并优化APN基因编辑克隆猪体细胞制备和再克隆胚胎生产方案,为今后实现APN基因编辑猪扩群提供技术参考,本研究首先从APN基因编辑猪耳部皮肤组织内分离建立了皮肤成纤维细胞系证明了其再克隆的可能性,接着利用Scriptaid处理体细胞或再克隆胚胎,探明了Scriptaid对体细胞体外生长和再克隆胚胎早期发育的影响,具体结果如下:（1）APN猪皮肤成纤维细胞建系及再克隆尝试。通过体外培养成功获得APN猪的皮肤成纤维细胞系,该细胞具有一般成纤维细胞的生物学特...
【文章来源】：安徽农业大学安徽省
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２－２细胞迁出后继续培养４ｄ?（４〇ｘ和１０００??．－＾＜ｘ
２结果??２．１?ＡＰＮ基因编辑猪的耳缘成纤维细胞鉴定??原代培养第６?ｄ，在显微镜下观察到有细胞迁出。镜下可观察到细胞立体、饱满，??呈纺锤形，边缘光滑，成片分布（如图２－１）。??鬌??ＨＩＩＨＨＲＩｒ??２００?Ｍｍ??图２－丨细胞从组织块迁出（４〇ｘ和ｌ〇〇ｘ）??Ｆｉｇ．２－１?Ｃｅｌｌｓ?ｍｉｇｒａｔｅｄ?ｆｒｏｍ?ｔｉｓｓｕｅ?ｂｌｏｃｋｓ?（４０＾?ａｎｄ?１０〇ｘ）??继续培养一段时间后，在倒置显微镜下观察到，获得的细胞形态规整，分布均匀，??细胞呈纺锤形，贴壁生长，从形态上看符合典型成纤维细胞的基本特征（如图２－２）。??５（Ｈ｝ｉｉｍ?２００?ｐｍ??图２－２细胞迁出后继续培养４ｄ?（４〇ｘ和１０００??Ｆｉｇ．２－２?Ｃｅｌｌｓ?ｃｏｎｔｉｎｕｅ?ｔｏ?ｃｕｌｔｕｒｅ?ｆｏｒ?４?ｄａｙｓ?ａｆｔｅｒ?ｍｉｇｒａｔｅｄ?ｆｒｏｍ?ｔｉｓｓｕｅ?ｂｌｏｃｋｓ（４０＾＜?ａｎｄ?１０〇ｘ）??细胞经冻存后复苏，依然可以保持较高的存活率，复苏后的细胞依然有着旺盛的??生命力。且复苏后细胞的生长状态与冻存前无明显差别（如图２－３）。??２７??
■■■■??Ｉ卜Ｊ??图２－３经冻存后复苏的细胞（４０＞？和ＩＯＯｘ）??Ｆｉｇ．２－３?Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ?ｃｅｌｌｓ?ａｆｔｅｒ?ｔｈａｗｉｎｇ?（４〇ｘ?ａｎｄ?１００＾）??解冻后与同期解冻的普通长白幼猪耳成纤维细胞同时培养，通过ＭＴＴ法绘制二??者生长曲线，发现两者之间生长趋势均呈典型“Ｓ”型，符合一般成纤维细胞的生长规??律（如图２－４ｈ??０．４－１??＋?ａｐｎ基因编辑猪??＋普通＾白幼猪??Ｑ?０－２－??。１＇??ＰＢＳ?Ｄ１?Ｄ２?Ｄ３?Ｄ４?Ｄ５?Ｄ６?Ｄ７?Ｄ８??图２－４不同来源的猪耳缘成纤维细胞的生长曲线??Ｆｉｇ．２－４?Ｔｈｅ?ｇｒｏｗｔｈ?ｃｕｒｖｅ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｐｉｇ?ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ??２．２?Ｓｃｒｉｐｔａｉｄ对ＡＰＮ猪耳缘成纤维细胞的影响??在显微镜下观察发现未经ＳｃＨｐｔａｉｄ处理的细胞能够正常、稳定地贴壁生长，细胞??呈现出纺锤形，梭形，细胞形态、大小均一，在皿底呈放射状均匀分布。??而经处理后的细胞，Ｓｃｒｉｐｔａｉｄ浓度越高，处理时间越长，其形态变化越明显。细??胞呈现出犹如高代次细胞般的形态，细胞之间接触不紧密，细胞形状不规则，细胞边??缘塌陷，细胞核凸起，经处理后的细胞，细胞增殖速度变慢且逐渐出现死亡现象。通??２８??
【参考文献】：
期刊论文
[1]CD163双等位基因编辑猪的制备及传代[J]. 魏迎辉,刘志国,徐奎,Evanna Huyhn,Paul Dyce,李继良,周伟良,董树仁,冯保亮,牟玉莲,Ju LangLi,李奎. 中国农业科学. 2018(04)
[2]羊成纤维细胞建系研究进展[J]. 豆兴堂. 现代畜牧兽医. 2014(12)
[3]太湖猪成纤维细胞系的建立及其生物学特性研究[J]. 张利娟,刘海峰,李学伟. 四川农业大学学报. 2008(01)
[4]分子育种成果之我国首例体细胞克隆猪[J]. 潘登科. 动物科学与动物医学. 2005(09)
[5]体细胞来源及培养代数对核移植重构胚发育的影响(英文)[J]. 雷蕾,刘忠华,王鸿,寇朝辉,吴昱琪,徐营,程勇,朱子玉,夏国良,陈大元. 遗传学报. 2003(03)
[6]由成年转基因山羊体细胞而来的克隆山羊[J]. 成勇,王玉阁,罗金平,沈玉,杨跃飞,鞠辉明,邹贤刚,徐少甫,劳为德,杜淼. 生物工程学报. 2002(01)
[7]生物医药中的转基因动物研究与开发[J]. 李宁,李青,刘建忠,徐新来,连正兴,傅红波,安道昌,朱炎,刘谦. 高技术通讯. 2000(11)
[8]牛α-S1-酪蛋白-乙肝病毒表面抗原融合基因在转基因羊中的表达[J]. 张靖溥,劳为德,成勇,成国祥,徐少甫. 生物工程学报. 1997(02)
[9]Construction of transgenic mice producing CAT to milk by co-injection of two overlapping fragments of bovine αs1-casein-CAT gene[J]. 劳为德,刘伟,成国祥,徐少甫,成勇. Science in China（Series C:Life Sciences）. 1996(06)
博士论文
[1]尿液分离细胞来源非整合人诱导多能干细胞库的建立[D]. 薛燕婷.中国科学技术大学 2013
[2]利用体细胞核移植技术生产猪克隆胚胎的研究[D]. 张运海.中国农业大学 2005
硕士论文
[1]新生猪肌组织成纤维细胞系和耳部皮肤成纤维细胞系的建立[D]. 邢蕾.华中农业大学 2007
本文编号：3473151
【文章来源】：安徽农业大学安徽省
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２－２细胞迁出后继续培养４ｄ?（４〇ｘ和１０００??．－＾＜ｘ
２结果??２．１?ＡＰＮ基因编辑猪的耳缘成纤维细胞鉴定??原代培养第６?ｄ，在显微镜下观察到有细胞迁出。镜下可观察到细胞立体、饱满，??呈纺锤形，边缘光滑，成片分布（如图２－１）。??鬌??ＨＩＩＨＨＲＩｒ??２００?Ｍｍ??图２－丨细胞从组织块迁出（４〇ｘ和ｌ〇〇ｘ）??Ｆｉｇ．２－１?Ｃｅｌｌｓ?ｍｉｇｒａｔｅｄ?ｆｒｏｍ?ｔｉｓｓｕｅ?ｂｌｏｃｋｓ?（４０＾?ａｎｄ?１０〇ｘ）??继续培养一段时间后，在倒置显微镜下观察到，获得的细胞形态规整，分布均匀，??细胞呈纺锤形，贴壁生长，从形态上看符合典型成纤维细胞的基本特征（如图２－２）。??５（Ｈ｝ｉｉｍ?２００?ｐｍ??图２－２细胞迁出后继续培养４ｄ?（４〇ｘ和１０００??Ｆｉｇ．２－２?Ｃｅｌｌｓ?ｃｏｎｔｉｎｕｅ?ｔｏ?ｃｕｌｔｕｒｅ?ｆｏｒ?４?ｄａｙｓ?ａｆｔｅｒ?ｍｉｇｒａｔｅｄ?ｆｒｏｍ?ｔｉｓｓｕｅ?ｂｌｏｃｋｓ（４０＾＜?ａｎｄ?１０〇ｘ）??细胞经冻存后复苏，依然可以保持较高的存活率，复苏后的细胞依然有着旺盛的??生命力。且复苏后细胞的生长状态与冻存前无明显差别（如图２－３）。??２７??
■■■■??Ｉ卜Ｊ??图２－３经冻存后复苏的细胞（４０＞？和ＩＯＯｘ）??Ｆｉｇ．２－３?Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ?ｃｅｌｌｓ?ａｆｔｅｒ?ｔｈａｗｉｎｇ?（４〇ｘ?ａｎｄ?１００＾）??解冻后与同期解冻的普通长白幼猪耳成纤维细胞同时培养，通过ＭＴＴ法绘制二??者生长曲线，发现两者之间生长趋势均呈典型“Ｓ”型，符合一般成纤维细胞的生长规??律（如图２－４ｈ??０．４－１??＋?ａｐｎ基因编辑猪??＋普通＾白幼猪??Ｑ?０－２－??。１＇??ＰＢＳ?Ｄ１?Ｄ２?Ｄ３?Ｄ４?Ｄ５?Ｄ６?Ｄ７?Ｄ８??图２－４不同来源的猪耳缘成纤维细胞的生长曲线??Ｆｉｇ．２－４?Ｔｈｅ?ｇｒｏｗｔｈ?ｃｕｒｖｅ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｐｉｇ?ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ??２．２?Ｓｃｒｉｐｔａｉｄ对ＡＰＮ猪耳缘成纤维细胞的影响??在显微镜下观察发现未经ＳｃＨｐｔａｉｄ处理的细胞能够正常、稳定地贴壁生长，细胞??呈现出纺锤形，梭形，细胞形态、大小均一，在皿底呈放射状均匀分布。??而经处理后的细胞，Ｓｃｒｉｐｔａｉｄ浓度越高，处理时间越长，其形态变化越明显。细??胞呈现出犹如高代次细胞般的形态，细胞之间接触不紧密，细胞形状不规则，细胞边??缘塌陷，细胞核凸起，经处理后的细胞，细胞增殖速度变慢且逐渐出现死亡现象。通??２８??
【参考文献】：
期刊论文
[1]CD163双等位基因编辑猪的制备及传代[J]. 魏迎辉,刘志国,徐奎,Evanna Huyhn,Paul Dyce,李继良,周伟良,董树仁,冯保亮,牟玉莲,Ju LangLi,李奎. 中国农业科学. 2018(04)
[2]羊成纤维细胞建系研究进展[J]. 豆兴堂. 现代畜牧兽医. 2014(12)
[3]太湖猪成纤维细胞系的建立及其生物学特性研究[J]. 张利娟,刘海峰,李学伟. 四川农业大学学报. 2008(01)
[4]分子育种成果之我国首例体细胞克隆猪[J]. 潘登科. 动物科学与动物医学. 2005(09)
[5]体细胞来源及培养代数对核移植重构胚发育的影响(英文)[J]. 雷蕾,刘忠华,王鸿,寇朝辉,吴昱琪,徐营,程勇,朱子玉,夏国良,陈大元. 遗传学报. 2003(03)
[6]由成年转基因山羊体细胞而来的克隆山羊[J]. 成勇,王玉阁,罗金平,沈玉,杨跃飞,鞠辉明,邹贤刚,徐少甫,劳为德,杜淼. 生物工程学报. 2002(01)
[7]生物医药中的转基因动物研究与开发[J]. 李宁,李青,刘建忠,徐新来,连正兴,傅红波,安道昌,朱炎,刘谦. 高技术通讯. 2000(11)
[8]牛α-S1-酪蛋白-乙肝病毒表面抗原融合基因在转基因羊中的表达[J]. 张靖溥,劳为德,成勇,成国祥,徐少甫. 生物工程学报. 1997(02)
[9]Construction of transgenic mice producing CAT to milk by co-injection of two overlapping fragments of bovine αs1-casein-CAT gene[J]. 劳为德,刘伟,成国祥,徐少甫,成勇. Science in China（Series C:Life Sciences）. 1996(06)
博士论文
[1]尿液分离细胞来源非整合人诱导多能干细胞库的建立[D]. 薛燕婷.中国科学技术大学 2013
[2]利用体细胞核移植技术生产猪克隆胚胎的研究[D]. 张运海.中国农业大学 2005
硕士论文
[1]新生猪肌组织成纤维细胞系和耳部皮肤成纤维细胞系的建立[D]. 邢蕾.华中农业大学 2007
本文编号：3473151
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