慢病毒介导氧化低密度脂蛋白受体基因沉默细胞株的构建

发布时间：2017-05-07 07:04

  本文关键词：慢病毒介导氧化低密度脂蛋白受体基因沉默细胞株的构建，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:建立体外LOX-1基因沉默细胞模型,用于探讨LOX-1与相关配体在细胞膜表面的相互作用,为研究LOX-1受体在早期动脉粥样硬化中的作用奠定基础。方法:以J774a.1细胞的总RNA为模板,通过PCR方法扩增得到LOX-1基因,并亚克隆至psi CHECK2载体上。设计得到LOX-1的sh RNA,并克隆至慢病毒基因沉默载体中,通过双荧光素酶报告基因筛选得到有效的LOX-1沉默sh RNA。将慢病毒包装质粒通过脂质体转染法转染至293T细胞中,进行慢病毒的包装。病毒悬液经过超滤浓缩后,再通过有限稀释法测定病毒浓缩液的滴度。使用病毒浓缩液对J774a.1细胞进行侵染并通过嘌呤霉素筛选获得稳定沉默的细胞株。最后对稳定沉默细胞株进行RT-PCR和Western blot检测,鉴定LOX-1的基因沉默情况。结果:成功扩增得到LOX-1基因序列并亚克隆至psi CHECK2载体中。设计得到LOX-1基因沉默sh RNA序列,通过双荧光素酶报告基因检测系统筛选得到了有效的sh RNA序列并克隆至慢病毒沉默载体中。通过共转染的方式成功包装得到介导LOX-1基因沉默的慢病毒。对重组病毒进行超滤浓缩及滴度测定,其滴度为4×107。之后使用病毒浓缩液侵染J774a.1巨噬细胞,利用puro抗生素筛选获得稳定的沉默细胞株。结论:成功构建了LOX-1稳定沉默的J774a.1细胞株,为今后研究LOX-1在动脉粥样硬化发病过程中的作用奠定了基础。
【关键词】：动脉粥样硬化 基因沉默 LOX-1
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R54
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 第一章 前言9-16
• 1.1 动脉粥样硬化发病机理9-10
• 1.2 LOX-1 在动脉粥样硬化的发病过程中的作用10-15
• 1.2.1 LOX-1 的简介11-12
• 1.2.2 LOX-1 与动脉粥样硬化早期12-13
• 1.2.3 LOX-1 对巨噬细胞泡沫化的影响13-14
• 1.2.4 LOX-1 与动脉血栓之间的关系14-15
• 1.3 结语15-16
• 第二章 实验材料与仪器16-19
• 2.1 材料16-17
• 2.1.1 细胞株16
• 2.1.2 质粒16
• 2.1.3 培养基16-17
• 2.1.4 主要试剂和工具酶17
• 2.2 主要仪器17-19
• 第三章 实验方法19-37
• 3.1 细胞复苏培养与冻存19-20
• 3.1.1 J774a.1 细胞的培养19-20
• 3.1.2 293T细胞的培养20
• 3.2 psiCHECK~(TM)2-LOX-1 重组载体的构建20-27
• 3.2.1 LOX-1 基因的调取20-23
• 3.2.2 psiCHECK~（TM）2-LOX-1 重组载体的构建23-27
• 3.3 LOX1shRNA—慢病毒载体构建27-29
• 3.3.1 shRNA的合成27
• 3.3.2 LOX1shRNA—慢病毒载体的构建27-28
• 3.3.3 双荧光素酶报告基因筛选有效shRNA28-29
• 3.4 LOX-1 基因沉默慢病毒的包装29-31
• 3.4.1 慢病毒的包装29-30
• 3.4.2 LOX-1 基因沉默慢病毒的浓缩纯化30
• 3.4.3 LOX-1 沉默慢病毒的滴度测定30-31
• 3.5 J774a.1-LOX-1 基因稳定沉默细胞株的建立31-32
• 3.5.1 测定puro抗性对J774a.1 细胞的有效致死浓度31
• 3.5.2 基因沉默慢病毒对J774a.1 细胞的侵染及稳转细胞株的筛选31-32
• 3.6 LOX-1 基因沉默效果的检测32-37
• 3.6.1 沉默细胞中LOX-1 的mRNA表达量的检测32-34
• 3.6.2 Western-blot检测基因沉默效果34-37
• 第四章 结果与讨论37-44
• 4.1 Total RNA纯度分析37
• 4.2 LOX-1 基因片段的获得37-38
• 4.3 菌落PCR及双酶切方法鉴定目的基因与T载体连接情况38-39
• 4.4 psiCHECK2-LOX-1 的PCR及双酶切鉴定39-40
• 4.5 LOX-1 的shRNA序列设计及筛选40-41
• 4.5.1 LOX-1 的shRNA序列设计40
• 4.5.2 LOX-1 的shRNA序列的筛选40-41
• 4.6 LOX-1 沉默慢病毒包装的滴度测定41
• 4.7 RT-PCR检测LOX-1 的沉默效果41-42
• 4.8 Western blot检测LOX-1 蛋白表达量42-43
• 4.9 结论43-44
• 参考文献44-49
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果49-50
• 致谢50

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 ;Lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1:protein,ligands,expression and pathophvsiological significance[J];Chinese Medical Journal;2007年05期

2 丁振华;低密度脂蛋白的氧化修饰及其理化、生物学性质的改变[J];国外医学(生理、病理科学与临床分册);1994年02期

3 陈瑗,周玫;LDL的氧化修饰和氧化修饰LDL的组成和结构变化[J];生物物理学报;1993年02期

  本文关键词：慢病毒介导氧化低密度脂蛋白受体基因沉默细胞株的构建，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：349377