小菜蛾中肠Polycalin基因克隆及其功能分析

发布时间：2017-05-07 07:10

  本文关键词：小菜蛾中肠Polycalin基因克隆及其功能分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：小菜蛾Plutella xylostella(Linnaeus)是一种世界性范围内广泛分布的十字花科蔬菜重要害虫。无公害Bt(Bacillus thuringiensis)生物农药的使用和转Bt基因作物的大规模种植,对小菜蛾的危害起到了一定的控制作用,但由于害虫长期处于Bt毒素蛋白的高压选择下,害虫对Bt产生抗性的潜在风险不容忽视,小菜蛾成为最早在田间发现对Bt产生抗性的害虫。Bt毒素的作用机理是与昆虫中肠上的刷状缘膜蛋白(Brush border membrane vesicles,BBMV)受体结合,形成寡聚化的结构,在中肠细胞膜上形成穿孔,导致昆虫死亡。可见,昆虫中肠受体蛋白在Bt毒素发挥效力中起着至关重要的作用。昆虫中肠Bt毒素的受体主要有氨肽酶、钙粘蛋白和碱性磷酸脂酶等,已有报道表明在家蚕、棉铃虫等昆虫的中肠中存在Polycalin蛋白,该蛋白也是与Bt毒素能结合的新的受体,但在小菜蛾中肠中未见研究报道。本研究以陕西杨凌地区对Bt毒素敏感的小菜蛾为研究对象,采用分子生物学技术对小菜蛾中肠Polycalin基因进行克隆。通过荧光定量分析了该基因在小菜蛾不同发育时期,幼虫不同部位的表达量。运用生物测定方法测定了Bt Cry1Ac毒素蛋白对小菜蛾的毒力,比较了小菜蛾取食不同浓度Cry1Ac毒素后Polycalin基因的表达量。运用蛋白质研究技术,通过合成多肽,制备Polycalin蛋白抗体,提取小菜蛾中肠受体BBMV蛋白,进行SDS-PAGE电泳,运用Western blot和Ligand blot的方法检测了Polycalin蛋白在小菜蛾中肠上的存在及其与Cry1Ac的结合特性,明确其蛋白功能。主要研究结果如下:1.通过PCR结合RACE技术克隆获得了小菜蛾Polycalin基因的全长序列,该基因全长为9102 bp,开放阅读框为8778 bp,编码2925个氨基酸,预测蛋白的等电点和分子量分别为4.39和326.38 kDa。推导的氨基酸序列中,N末端含有20个氨基酸组成的信号肽,含有67个O-糖基化位点,14个N-糖基化位点,7个脂质运载蛋白位点,氨基酸序列具有典型的中肠受体蛋白的特征,即2个GPI结合位点。小菜蛾Polycalin基因与已报道的其他昆虫的氨基酸序列比对,一致性为35.9%-50.5%。2.通过Real-time PCR技术检测了Polycalin基因的表达情况。发现Polycalin基因在小菜蛾各个发育阶段均可以表达,幼虫期表达量远高于蛹期和成虫期,其中以3龄幼虫表达量最高,成虫期表达量最低。同时比较了小菜蛾幼虫头部、胸部和腹部Polycalin基因表达情况,结果表明Polycalin在腹部表达量最高,头部和胸部表达量较低。3.给小菜蛾3龄幼虫饲喂不同浓度的Bt Cry1Ac毒素蛋白,运用生物测定技术测定了毒素对小菜蛾的致死作用,获得毒力方程为y=-2.125+0.838x,LC50为343.5 ng/ml。4.通过Real-time PCR技术检测发现小菜蛾3龄幼虫取食活化的不同浓度Bt Cry1Ac毒素蛋白后,Polycalin基因的表达量下降,但随着取食时间的延长,小菜蛾Polycalin的表达量逐渐恢复。5.根据克隆获得的Polycalin基因序列,通过合成多肽技术,制备了Polycalin蛋白抗体。对提取的小菜蛾中肠受体BBMV蛋白进行SDS-PAGE电泳,运用Western blot技术,可以检测到中肠BBMV蛋白中有一个约300 kDa的条带可以与Polycalin蛋白抗体结合,说明中肠上确实存在Polycalin蛋白。6.对提取的小菜蛾中肠受体BBMV蛋白,通过Ligand blot方法,运用Bt Cry1Ac活化毒素及其抗体检测,发现这个约300 kDa的Polycalin蛋白条带可以与Bt Cry1Ac活化毒素结合。通过以上各方面的研究,发现小菜蛾中肠确实存在Polycalin基因,而且该基因表达的蛋白可以与Bt毒素结合,具有受体功能。
【关键词】：小菜蛾 Polycalin Bt 克隆 功能分析
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S433.4
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-13
• 第一章 文献综述13-24
• 1.1 引言13
• 1.2 Bt的研究进展13-17
• 1.2.1 Bt概述13-14
• 1.2.2 Bt毒素的结构和功能14-15
• 1.2.3 Bt毒蛋白的作用机制15-17
• 1.3 昆虫中肠Bt受体蛋白的研究17-18
• 1.4 Bt应用进展及抗性研究现状18-21
• 1.4.1 Bt应用进展18-19
• 1.4.2 Bt抗性机制19-21
• 1.5 小菜蛾Bt抗性的研究进展21
• 1.6 本研究的目的与意义21-22
• 1.7 研究内容22-23
• 1.8 技术路线23-24
• 第二章 Polycalin基因克隆24-44
• 2.1 实验材料24-25
• 2.1.1 供试昆虫24
• 2.1.2 主要试剂24
• 2.1.3 主要仪器24-25
• 2.1.4 培养基及试剂的配制25
• 2.2 实验方法25-33
• 2.2.1 总RNA的提取25-26
• 2.2.2 cDNA的合成26-27
• 2.2.3 5'RACE和 3'RACE cDNA模板的制备27-28
• 2.2.4 引物的设计28-29
• 2.2.5 PCR反应体系和程序29-31
• 2.2.6 PCR产物回收与纯化31
• 2.2.7 连接反应31-32
• 2.2.8 转化32
• 2.2.9 阳性克隆的鉴定32-33
• 2.2.10 序列分析33
• 2.3 结果与分析33-42
• 2.3.1 小菜蛾总RNA提取33-34
• 2.3.2 普通PCR和RACE PCR结果34-35
• 2.3.3 Polycalin基因的序列分析35-39
• 2.3.4 序列同源性分析39-42
• 2.3.5 系统发育分析42
• 2.4 结论与讨论42-44
• 第三章 小菜蛾Polycalin基因的时空表达44-51
• 3.1 实验材料44
• 3.1.1 供试昆虫44
• 3.1.2 主要试剂和仪器44
• 3.2 实验方法44-46
• 3.2.1 小菜蛾不同发育阶段样品收集44
• 3.2.2 小菜蛾幼虫不同部位样品收集44
• 3.2.3 RNA的提取44
• 3.2.4 cDNA第一链的合成44-45
• 3.2.5 引物设计与合成45
• 3.2.6 qPCR反应45-46
• 3.2.7 引物扩增效率检测46
• 3.2.8 数据处理46
• 3.3 结果与分析46-49
• 3.3.1 引物的特异性和扩增效率46-48
• 3.3.2 Polycalin基因在小菜蛾不同发育阶段的表达48
• 3.3.3 Polycalin基因在小菜蛾幼虫不同部位的表达分析48-49
• 3.4 结论与讨论49-51
• 第四章 小菜蛾取食Cry1Ac毒素后Polycalin基因的表达量51-56
• 4.1 材料与方法51-52
• 4.1.1 供试昆虫及试剂51
• 4.1.2 Cry1Ac杀虫蛋白对小菜蛾的毒力测定51
• 4.1.3 收集取食不同浓度的Cry1Ac毒素小菜蛾样品51-52
• 4.1.4 小菜蛾幼虫RNA的提取及cDNA第一链的合成52
• 4.1.5 实时荧光定量检测52
• 4.1.6 数据处理52
• 4.2 结果与分析52-53
• 4.2.1 Cry1Ac毒素蛋白对小菜蛾幼虫的致死效果52
• 4.2.2 小菜蛾取食不同浓度的Cry1Ac毒素后Polycalin基因的表达量52-53
• 4.3 结论与讨论53-56
• 第五章 小菜蛾中肠Polycalin蛋白的功能分析56-65
• 5.1 材料与方法56-59
• 5.1.1 供试昆虫56
• 5.1.2 主要试剂56
• 5.1.3 主要仪器56
• 5.1.4 试剂配制56-59
• 5.2 实验方法59-61
• 5.2.1 小菜蛾幼虫中肠受体蛋白BBMV的提取59
• 5.2.2 BBMV蛋白浓度测定59
• 5.2.3 BBMV蛋白的SDS-PAGE电泳分离59-60
• 5.2.4 Polycalin蛋白抗体的制备60
• 5.2.5 Polycalin蛋白的Western blot检测60
• 5.2.6 Polycalin蛋白的Ligand blot检测60-61
• 5.3 结果与分析61-62
• 5.3.1 小菜蛾中肠BBMV蛋白的SDS-PAGE分离结果61
• 5.3.2 Polycalin蛋白的Western blot检测结果61-62
• 5.3.3 Polycalin蛋白的Ligand blot检测结果62
• 5.4 结论与讨论62-65
• 第六章 全文总结65-66
• 参考文献66-75
• 致谢75-76
• 作者简介76

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