农杆菌介导的谷氧还蛋白基因CsGRX4对黄瓜遗传转化体系的建立
本文关键词：农杆菌介导的谷氧还蛋白基因CsGRX4对黄瓜遗传转化体系的建立，，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：转基因技术在黄瓜上的应用一直受再生频率和遗传转化频率低的限制,难以提高遗传转化频率。因此,建立一个高效的遗传转化体系并进行基因的遗传转化对黄瓜抗病新种质的创制及转基因研究具有十分重要的意义。本研究以津研四号和长春密刺为实验材料,利用黄瓜子叶节为外植体,在优化黄瓜再生体系的基础上,通过根癌农杆菌介导法利用黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX4对黄瓜进行遗传转化,并对各种影响遗传转化的因素进行优化,为黄瓜的高频遗传转化奠定基础。本试验的主要结果如下:1.在原有的基础上优化了黄瓜的再生体系。津研四号的最佳芽诱导培养基为MS培养基附加3.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L ABA+1.5 mg/L AgNO3,出芽率和每外植体出芽数分别达到了90.00%和2.71;长春密刺的最佳芽诱导培养基为MS培养基附加2.0 mg/L6-BA+1.0 mg/L ABA+1.5 mg/L AgNO3,出芽率和每外植体出芽数分别达到了87.22%和2.53;无菌苗的适宜苗态为种皮完全脱落,子叶未展开;子叶节最优的切割方式为下胚轴纵切,保留单片子叶,切除子叶三分之二,去除顶芽,保留1 mm叶柄;外植体最佳的接种方式为叶背向下微斜插入芽诱导培养基中;2.确定了黄瓜子叶节遗传转化的Basta的筛选压为3.0 mg/L;选择头孢霉素浓度500mg/L作为芽诱导培养基的抑菌浓度;3.确定了预培养时间及农杆菌菌液浓度等影响遗传转化的因素的最优处理。最佳预培时间为2-3 d;农杆菌侵染的最佳浓度为0.4;农杆菌的最佳侵染时间为10 min;最佳共培养时间为2 d;农杆菌菌液中乙酰丁香酮的最佳添加浓度为1.0 g/L。4.进行了抗性株的移栽及抗性筛选和PCR检测。得到津研四号抗性株12株,Basta喷施后成活率为0;获得长春密刺抗性植株15株,皆为阴性株。
【关键词】：黄瓜 再生 CsGRX4 遗传转化 根癌农杆菌
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S642.2
【目录】：
- 摘要6-7
- ABSTRACT7-12
- 第一章 文献综述12-17
- 1.1 黄瓜再生的研究进展12-14
- 1.1.1 基因型12-13
- 1.1.2 外植体类型13
- 1.1.3 苗龄和苗态13-14
- 1.1.4 激素种类14
- 1.1.5 其它试剂14
- 1.2 黄瓜遗传转化研究进展14-15
- 1.2.1 遗传转化的方法14
- 1.2.2 黄瓜遗传转化现状14-15
- 1.2.3 影响遗传转化效率的因素15
- 1.2.4 农杆菌遗传转化存在问题15
- 1.3 谷氧还蛋白简介15-16
- 1.4 本研究的目的与意义16-17
- 第二章 黄瓜再生体系的建立17-29
- 2.1 材料与方法17-20
- 2.1.1 试验材料17
- 2.1.2 试验方法17-20
- 2.2 结果与讨论20-26
- 2.2.1 消毒体系的建立20-21
- 2.2.2 不同的外植体种类对再生的影响21-22
- 2.2.3 外植体切割及接种方式对再生的影响22-23
- 2.2.4 不同苗态对再生的影响23-24
- 2.2.5 不同激素配比对再生的影响24
- 2.2.6 硝酸银对再生的影响24-25
- 2.2.7 不同浓度激素对芽伸长的影响25
- 2.2.8 不同培养基配方对生根的影响25-26
- 2.3 讨论26-28
- 2.3.1 黄瓜种子消毒体系26
- 2.3.2 不同的外植体类型26-27
- 2.3.3 外植体切割及接种方式27
- 2.3.4 外植体的苗态27
- 2.3.5 激素配比及其他添加物质的影响27-28
- 2.4 结论28-29
- 2.4.1 建立了黄瓜种子的最优消毒体系28
- 2.4.2 优化了黄瓜的再生体系28-29
- 第三章 黄瓜遗传转化体系的建立29-45
- 3.1 材料与方法29-32
- 3.1.1 试验材料29
- 3.1.2 试验方法29-32
- 3.2 结果与分析32-42
- 3.2.1 Basta筛选压的确定32-34
- 3.2.2 头孢霉素（Cef）对外植体生长的影响34-35
- 3.2.3 预培养时间对遗传转化的影响35
- 3.2.4 农杆菌浓度对遗传转化的影响35-36
- 3.2.5 农杆菌侵染时间对遗传转化的影响36-37
- 3.2.6 共培养时间对遗传转化的影响37-38
- 3.2.7 不同苗态对遗传转化的影响38
- 3.2.8 子叶黄化与否对遗传转化的影响38-39
- 3.2.9 外植体的切割及接种方式对遗传转化的影响39-40
- 3.2.10 乙酰丁香酮对遗传转化的影响40-41
- 3.2.11 Basta喷施检测41-42
- 3.2.12 PCR检测42
- 3.3 讨论42-44
- 3.3.1 Basta筛选压的确定42
- 3.3.2 Cef抑菌浓度的确定42-43
- 3.3.3 预培养时间43
- 3.3.4 共培养时间43
- 3.3.5 感菌时间及农杆菌浓度43
- 3.3.6 外植体切割以及接种方式43
- 3.3.7 苗态43-44
- 3.3.8 外源物质的添加44
- 3.3.9 转基因植株的检测44
- 3.4 结论44-45
- 第四章 结论45-46
- 4.1 再生体系的建立45
- 4.2 遗传转化体系的建立45-46
- 参考文献46-49
- 致谢49-50
- 作者简介50
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6 缪e
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