EphA8基因表达对乳腺癌细胞侵袭和迁移影响的相关机制研究

发布时间：2021-11-17 01:14

　　目的:通过对乳腺癌及癌旁正常乳腺组织中EphA8的表达的检测,并以EphA8为靶点,研究调节EphA8基因的表达对乳腺癌细胞迁移侵袭的影响,在一定程度上阐明调控乳腺癌细胞侵袭迁移的分子机制,明确其在乳腺癌的发生、发展中的病理意义。方法:第一部分分析EphA8在乳腺癌中的表达及与患者预后的相关性1.收集南通大学附属医院150例乳腺癌石蜡组织标本及相应癌旁组织标本（含完整临床资料和随访结果）制备组织芯片后,用免疫组化检测肿瘤组织和癌旁组织中EphA8的表达,对比分析。2.检测EphA8的表达高低与乳腺癌患者临床病理特征的关系。3.用统计学软件分析EphA8的表达与乳腺癌的发病及患者预后的相关性。第二部分针对EphA8的shRNA抑制乳腺癌生长的体外研究1.体外培养多株乳腺癌细胞系,用qRT-PCR和WB鉴定筛选出高表达EphA8的乳腺癌细胞系。2.设计并合成4对针对EphA8的干扰靶序列,通过一部分实时定量PCR（qPCR）和免疫印迹（WB）分析这4个shRNA抑制EphA8表达的效果,筛选出沉默作用最强的一个shRNA片段。3.用脂质体转染的方法转染EphA8-shRNA至高表达EphA... 

【文章来源】：苏州大学江苏省 211工程院校

【文章页数】：76 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

图２－２?ＷＢ结果表明ＥＰＨＡ８蛋白在ＭＣＦ－７细胞表达量最高，在ＭＣＦ－ｌＯＡ细胞??表达量最低

办斤妨基因表达对乳腺癌细胞侵袭和迁移影响的相关机制研究?第三章ＥｐｈＡ８对乳腺癌细胞侵袭及迁移影响的体外研究??表２－５?Ｒｅａ丨ｔｉｍｅ－ＰＣＲ反应体系??Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ?Ｖｏｌｕｍｅ（卩?Ｉ）??ｄｄＨ２０?８．２??ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ?ｑＰＣＲ?Ｍａｓｔｅｒ?Ｍｉｘ?（２ｘ）?１０．０??Ｆｏｒｗａｒｄ?ｐｒｉｍｅｒ?１０?｜ｉＭ?０．４??Ｒｅｖｅｒｓｅ?ｐｒｉｍｅｒ?１０?ｐ．Ｍ?０．４??ｃＤＮＡ?１．０??Ｔｏｔａｌ?ｖｏｌｕｍｅ?２０．０??（３）?ＰＣＲ?扩增??扩增条件：９４°Ｃ?１０ｍｉｎ，（９４°Ｃ?２０?秒，５５°Ｃ?２０?秒，７２°Ｃ?２０?秒）４０?个循环??３．２．１．３实验结果??根据ＲＴ－ＰＣＲ结果，如图２－３，?ＮＣ组和ＣＫ组中ＥｐｈＡ８蛋白表达无明显变化，??各ｓｈＲＮＡ组中ＥｐｈＡ８蛋白表达量均出现不同程度降低，其中ｓｈＲＮＡ３的沉默效率最??高，故筛选出ｓｈＲＮＡ３组可用于进一步实验。??１?１?Ｍｅａｎ士?ＳＤ??１．２?ｐ??ｆ?丨ｍ??＿??＾?０．８?－??安（＞？（，－?＿＿，＿??＜??§?＊＊??ｃ?０．４?－?，??Ｃ??００?￣－—??ｒ?０．２?－??〇．〇?１—１￣１???？—Ｉ?１—？???？???Ｌ＿ｊ???ＮＣ?ＣＫ?ｓｈＲＮＡ－１?ｓｈＲＮＡ－２?ｓｈＲＮＡ－３?ｓｈＲＮＡ－４??图２－３?ＲＴ结果表明：ｓｈＲＮＡ３沉默效率最高（＊＊：?ｐ＜０．０１）??３．２．２?ＷＢ靶点筛选??２７??

姑基因表达对乳腺癌细胞侵袭和迁移影响的相关机制研究?第二章ＥｐｈＡ８对乳腺癌细胞侵袭及迁移影响的体外研究??ＦＰＨＡＨ?Ｉ?Ｉ－＇＾１?５Ｄ??０．Ｔ??０．？?＇?；??０．５??ｇ?０．４?［?？＊??？?ｉ?ｓ?ｒｉ?■＊??ｊ?；二?ｍ??０．２??…丨?Ｉ?：??〇。Ｍ?■?１?＊?＇?１，１?ｉ?，?Ｉ?，?：?？??ＨＣ?ＣＫ?ＳＮＲＮＡ１?ＳｈＲＮＡ２?ＳｈｆｔＮＡｌ?ＳｈＲＮＡ＜４??一一?一一?一一??Ｐ－ａｃｔｉｎ?ｍｍｍ?＾?ｍａｍ??图２－４?ＷＢ结果显示：转染后ｓｈＲＮ＾－３组ＥＰＨＡ８蛋白表达最少，沉默效果最好??３．２．３沉默及ＮＣ稳转株构建??３．２．３．１实验材料??ＭＣＦ－７?细胞（ＣＴＣＣ），?１６４０Ｍ?培养基（Ｈｙｃｌｏｎｅ），１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ），ｓｈＲＮＡ－３??细胞培养箱，倒置显微镜，荧光显微镜，离心机??３．２＿３＿２实验方法：??（１）ＭＣＦ－７细胞加入１６４０培养基，铺于细胞培养皿中，于３７°Ｃ，?５％培养箱培养，??（２）待细胞长满后，将细胞消化后分于６孔板中，达到８０％黏连后按上述转染方??法，分别转入ＮＣ质粒和ｓｈＲＮＡ－３质粒；??（３）?２４ｈ观察细胞状况，通过５?｜ｘｇ／ｍｌ的嘌呤霉素筛选含有重组载体的细胞。??（４）单克隆分眩??３．２Ｊ．３实验结果??我们分别用ＮＣ质粒和ｓｈＲＮＡ－３质粒对ＭＣＦ－７细胞进行转染，后通过嘌呤霉素??筛选出可以稳定生长的细胞株用于后续实验。（图２－５）??２９??

【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3499935