黄花苜蓿MfNAC34基因的特性分析
发布时间：2021-11-17 06:05
黄花苜蓿（Medicago falcata）在耐冷、耐盐和抗旱等方面具有突出的抗逆特性,是进行豆科牧草品种改良的优异种质资源和重要基因库。许多研究表明,NAC转录因子家族在调控植物生长发育以及逆境应答过程中发挥重要作用。本研究以实验室已从黄花苜蓿中克隆获得的1个cDNA序列为基础,推导其为编码206个氨基酸的蛋白质,而其9-142位氨基酸序列为公认的NAM结构域,且该蛋白与蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）MtNAC34的同源性最高。因此,本研究将该cDNA序列命名为MfNAC34基因。MfNAC34的分子量为23.52kDa,理论等电点为4.24。生物信息学分析及预测显示:MfNAC34是无信号肽和跨膜结构域且定位在细胞核内的亲水性蛋白。烟草（Nicotiana Benthamiana）表皮细胞瞬时表达MfNAC34-sGFP融合蛋白,激光共聚焦显微镜观测结果进一步验证MfNAC34定位于细胞核内。酵母AH109细胞转化实验验证了MfNAC34具有转录激活功能,且转录激活结构域位于蛋白的C端。MfNAC34基因在黄花苜蓿茎中的表达最大,且NaCl、山梨醇和0℃胁迫均可...
【文章来源】：内蒙古大学内蒙古自治区 211工程院校
【文章页数】：51 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
载体pGBKT7-DBD-MfNAC34（c）示意图
内蒙古大学硕士学位论文142.2.4MfNAC34亚细胞定位验证为了进一步验证生物信息学预测MfNAC34定位在细胞核内的分析结果，本研究构建了pCAMBIA1300（35S-MfNAC34-sGFP）瞬时表达载体（如图2.2）。MfNAC34蛋白与GFP蛋白融合表达，利用GFP蛋白自发绿色荧光的特点，可对MfNAC34进行亚细胞定位。（1）构建pCAMBIA1300（35S-MfNAC34-sGFP）融合表达载体依据已有的完整ORF序列的目的片段与pCAMBIA1300(35S-sGFP)载体序列，设计特异性引物pCAMMfNAC34-R和pCAMMfNAC34-F（表2.2），以pMD19-T-MfNAC34质粒为模板，进行PCR反应扩增不含有终止密码子的MfNAC34全长ORF序列。PCR反应体系同2.2.3（1）。PCR反应条件为95℃预变性5min；95℃变性1min，58℃退火40S，72℃延伸40S，30个循环；72℃10min，15℃30min。PCR产物纯化后，经KpnⅠ和SalⅠ酶切，获得MfNAC34基因酶切片段，酶切体系如下：组分反应1反应2pCAMBIA1300（35S-sGFP）（200μg/μL）2μL—MfNAC34片段—16μLQuickCutTMKpnⅠ0.5μL1μLQuickCutTMSalⅠ0.5μL1μL10×QuickCutBuffer1μL2μLddH2O6μL—pCAMBIA1300（35S-sGFP）质粒经酶切后做纯化处理，再经去磷酸化酶处理后，获得含有与MfNAC34基因酶切片段相同粘性末端的片段。分别纯化经酶切获得的MfNAC34基因酶切片段和经酶切后去磷酸化酶处理的pCAMBIA1300（35S-sGFP）质粒片段，用T4连接酶连接，构建pCAMBIA1300（35S-MfNAC34-sGFP）融合表达载体。连接体系如下：图2.2重组质粒pCAMBIA1300(35S-MfNAC34-sGFP)Fig.2.2ConstructionofthepCAMBIA1300(35S-MfNAC34-sGFP)recombinantplasmid
fNAC34基因拟南芥纯合体植株的获得将T0代拟南芥转化种子表面消毒后，播种在含有40mg/mLGen的1/2MS固体培养基上，光照培养箱培养2周，获得可以正常发芽生长的幼苗。移栽至含有蛭石的营养土（营养土与蛭石比例为3:1）中，在相对湿度60%，16h/8h光照/黑暗的温室条件下培养生长。同时，采集叶片，提取DNA，进行PCR扩增鉴定。培养至荚果成熟时，单株收集获得T1代种子。将不同转化株系的T1代种子播种在含有40mg/mLGen的1/2MS固体培养基上，培养2周后，选取具有抗性性状分离比为3:1的株系移栽至营养土中继续培养，获得T2代种子。将图2.3pPZP221(35S-MfNAC34-NOS)重组质粒构建Fig.2.3ConstructionofthepPZP221(35S-MfNAC34-NOS)recombinantplasmid
【参考文献】：
期刊论文
[1]黄花苜蓿MfNAC95基因鉴定及其应答盐胁迫的表达分析[J]. 张立全,贾旭慧,赵静玮,王旌吉,哈斯阿古拉. 中国草地学报. 2020(01)
[2]不同盐分对黄花苜蓿早期幼苗生长及离子积累的影响[J]. 武祎,田雨,宋彦涛. 中国草地学报. 2019(04)
[3]柳树NAC基因的克隆与表达模式分析[J]. 田雪瑶,周洁,王保松,何开跃,何旭东. 南京林业大学学报(自然科学版). 2020(01)
[4]黄花苜蓿MfNAC37基因的克隆及盐胁迫下的表达分析[J]. 张立全,贾旭慧,赵静玮,刘雨欣,哈斯阿古拉. 中国草地学报. 2019(03)
[5]13个苹果NAC转录因子基因的克隆与表达分析[J]. 李慧峰,董庆龙,赵强,冉昆. 植物遗传资源学报. 2019(04)
[6]烟草中蛋白激酶基因NtCIPK3的表达载体构建及表达分析[J]. 陈倩,杨尚谕,卓维,李佳皓,彭双,王静,李立芹. 华北农学报. 2018(06)
[7]紫花苜蓿和黄花苜蓿种子萌发期对PEG模拟干旱胁迫的响应[J]. 刘佳月,杜建材,王照兰,崔乐乐,赵彦慧. 中国草地学报. 2018(03)
[8]烟草NAC4基因的克隆及其抗旱功能分析[J]. 代婷婷,姚新转,吕立堂,赵德刚. 农业生物技术学报. 2018(05)
[9]青花菜转录因子基因BoNAC1的克隆与表达分析[J]. 蒋明,张慧娟,张志仙,陈珍,管铭,刘洁,陈孝赏. 核农学报. 2018(04)
[10]三七NAC转录因子基因PnNAC1的克隆及表达特性分析[J]. 王国东,李金晶,白智伟,关瑞攀,杨野,曲媛,崔秀明,刘迪秋. 华北农学报. 2017(04)
博士论文
[1]苹果NAC转录因子调控干旱胁迫响应和矮化性状的研究[D]. 贾东峰.西北农林科技大学 2019
[2]黄花苜蓿MfNAC3、MfNAC4分别参与低温和盐胁迫的分子机制初探[D]. 曲悦婷.中国农业大学 2016
[3]鹰嘴豆NAC转录因子CarNAC4、CarNAC5和CarNAC2参与逆境胁迫响应的功能分析[D]. 于兴旺.南京农业大学 2014
[4]黄花苜蓿非生物胁迫数据挖掘与系统分析[D]. 苗震龑.中国农业大学 2014
[5]中国黄花苜蓿野生种质资源研究[D]. 王俊杰.内蒙古农业大学 2008
硕士论文
[1]黄花苜蓿MfNAC35基因的功能分析[D]. 常娜.内蒙古大学 2018
[2]紫花苜蓿与黄花苜蓿抗旱转录组学研究[D]. 刘佳月.中国农业科学院 2018
[3]低温胁迫下黄花苜蓿蛋白质组的初步分析[D]. 王楠.中国农业科学院 2008
[4]黄花苜蓿抗旱、耐盐生理特性及其抗性机理的初步研究[D]. 吕世杰.内蒙古农业大学 2007
[5]黄花苜蓿幼苗抗旱性及遗传多样性研究[D]. 王赫.东北师范大学 2006
本文编号：3500350
【文章来源】：内蒙古大学内蒙古自治区 211工程院校
【文章页数】：51 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
载体pGBKT7-DBD-MfNAC34（c）示意图
内蒙古大学硕士学位论文142.2.4MfNAC34亚细胞定位验证为了进一步验证生物信息学预测MfNAC34定位在细胞核内的分析结果，本研究构建了pCAMBIA1300（35S-MfNAC34-sGFP）瞬时表达载体（如图2.2）。MfNAC34蛋白与GFP蛋白融合表达，利用GFP蛋白自发绿色荧光的特点，可对MfNAC34进行亚细胞定位。（1）构建pCAMBIA1300（35S-MfNAC34-sGFP）融合表达载体依据已有的完整ORF序列的目的片段与pCAMBIA1300(35S-sGFP)载体序列，设计特异性引物pCAMMfNAC34-R和pCAMMfNAC34-F（表2.2），以pMD19-T-MfNAC34质粒为模板，进行PCR反应扩增不含有终止密码子的MfNAC34全长ORF序列。PCR反应体系同2.2.3（1）。PCR反应条件为95℃预变性5min；95℃变性1min，58℃退火40S，72℃延伸40S，30个循环；72℃10min，15℃30min。PCR产物纯化后，经KpnⅠ和SalⅠ酶切，获得MfNAC34基因酶切片段，酶切体系如下：组分反应1反应2pCAMBIA1300（35S-sGFP）（200μg/μL）2μL—MfNAC34片段—16μLQuickCutTMKpnⅠ0.5μL1μLQuickCutTMSalⅠ0.5μL1μL10×QuickCutBuffer1μL2μLddH2O6μL—pCAMBIA1300（35S-sGFP）质粒经酶切后做纯化处理，再经去磷酸化酶处理后，获得含有与MfNAC34基因酶切片段相同粘性末端的片段。分别纯化经酶切获得的MfNAC34基因酶切片段和经酶切后去磷酸化酶处理的pCAMBIA1300（35S-sGFP）质粒片段，用T4连接酶连接，构建pCAMBIA1300（35S-MfNAC34-sGFP）融合表达载体。连接体系如下：图2.2重组质粒pCAMBIA1300(35S-MfNAC34-sGFP)Fig.2.2ConstructionofthepCAMBIA1300(35S-MfNAC34-sGFP)recombinantplasmid
fNAC34基因拟南芥纯合体植株的获得将T0代拟南芥转化种子表面消毒后，播种在含有40mg/mLGen的1/2MS固体培养基上，光照培养箱培养2周，获得可以正常发芽生长的幼苗。移栽至含有蛭石的营养土（营养土与蛭石比例为3:1）中，在相对湿度60%，16h/8h光照/黑暗的温室条件下培养生长。同时，采集叶片，提取DNA，进行PCR扩增鉴定。培养至荚果成熟时，单株收集获得T1代种子。将不同转化株系的T1代种子播种在含有40mg/mLGen的1/2MS固体培养基上，培养2周后，选取具有抗性性状分离比为3:1的株系移栽至营养土中继续培养，获得T2代种子。将图2.3pPZP221(35S-MfNAC34-NOS)重组质粒构建Fig.2.3ConstructionofthepPZP221(35S-MfNAC34-NOS)recombinantplasmid
【参考文献】：
期刊论文
[1]黄花苜蓿MfNAC95基因鉴定及其应答盐胁迫的表达分析[J]. 张立全,贾旭慧,赵静玮,王旌吉,哈斯阿古拉. 中国草地学报. 2020(01)
[2]不同盐分对黄花苜蓿早期幼苗生长及离子积累的影响[J]. 武祎,田雨,宋彦涛. 中国草地学报. 2019(04)
[3]柳树NAC基因的克隆与表达模式分析[J]. 田雪瑶,周洁,王保松,何开跃,何旭东. 南京林业大学学报(自然科学版). 2020(01)
[4]黄花苜蓿MfNAC37基因的克隆及盐胁迫下的表达分析[J]. 张立全,贾旭慧,赵静玮,刘雨欣,哈斯阿古拉. 中国草地学报. 2019(03)
[5]13个苹果NAC转录因子基因的克隆与表达分析[J]. 李慧峰,董庆龙,赵强,冉昆. 植物遗传资源学报. 2019(04)
[6]烟草中蛋白激酶基因NtCIPK3的表达载体构建及表达分析[J]. 陈倩,杨尚谕,卓维,李佳皓,彭双,王静,李立芹. 华北农学报. 2018(06)
[7]紫花苜蓿和黄花苜蓿种子萌发期对PEG模拟干旱胁迫的响应[J]. 刘佳月,杜建材,王照兰,崔乐乐,赵彦慧. 中国草地学报. 2018(03)
[8]烟草NAC4基因的克隆及其抗旱功能分析[J]. 代婷婷,姚新转,吕立堂,赵德刚. 农业生物技术学报. 2018(05)
[9]青花菜转录因子基因BoNAC1的克隆与表达分析[J]. 蒋明,张慧娟,张志仙,陈珍,管铭,刘洁,陈孝赏. 核农学报. 2018(04)
[10]三七NAC转录因子基因PnNAC1的克隆及表达特性分析[J]. 王国东,李金晶,白智伟,关瑞攀,杨野,曲媛,崔秀明,刘迪秋. 华北农学报. 2017(04)
博士论文
[1]苹果NAC转录因子调控干旱胁迫响应和矮化性状的研究[D]. 贾东峰.西北农林科技大学 2019
[2]黄花苜蓿MfNAC3、MfNAC4分别参与低温和盐胁迫的分子机制初探[D]. 曲悦婷.中国农业大学 2016
[3]鹰嘴豆NAC转录因子CarNAC4、CarNAC5和CarNAC2参与逆境胁迫响应的功能分析[D]. 于兴旺.南京农业大学 2014
[4]黄花苜蓿非生物胁迫数据挖掘与系统分析[D]. 苗震龑.中国农业大学 2014
[5]中国黄花苜蓿野生种质资源研究[D]. 王俊杰.内蒙古农业大学 2008
硕士论文
[1]黄花苜蓿MfNAC35基因的功能分析[D]. 常娜.内蒙古大学 2018
[2]紫花苜蓿与黄花苜蓿抗旱转录组学研究[D]. 刘佳月.中国农业科学院 2018
[3]低温胁迫下黄花苜蓿蛋白质组的初步分析[D]. 王楠.中国农业科学院 2008
[4]黄花苜蓿抗旱、耐盐生理特性及其抗性机理的初步研究[D]. 吕世杰.内蒙古农业大学 2007
[5]黄花苜蓿幼苗抗旱性及遗传多样性研究[D]. 王赫.东北师范大学 2006
本文编号：3500350
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3500350.html
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